Développement de tests 3-plexes

Trois tests 3-plexes, contenant deux couples d’amorces associés aux champignons et la référence interne ont été évalués :

o PchQ-TAMRA / PalQ-ROX / Vvactin-FAM o PchQ-TAMRA / BobQ-ROX / Vvactin-FAM o BpvQ-TAMRA / PalQ-ROX / Vvactin-FAM

1.2.1. Comparaison des profils d’amplification et de fusion en 1-

plexe et 3-plexe

Dans ces conditions, une lecture claire des profils d’amplifications et de fusions relatifs à chaque couple/fluorophore, ainsi que l’obtention de performances satisfaisantes (efficacité, gamme de quantification) nécessitent l’optimisation des concentrations en amorces. Des résultats similaires ayant été obtenus sur les trois 3-plexes (Tab. 8), le 3-plexe « PchQ- TAMRA / PalQ-ROX / Vvactin-FAM » a ici été pris comme exemple (A. Fig.3, 4, 5).

Les profils présentent les caractéristiques typiques d’une courbe d’amplification RT-qPCR (A. Fig. 3, A. Fig. 4, A. Fig. 5), soit une phase exponentielle, une phase linéaire et un plateau. Toutefois, les profils d’amplification observés dans le filtre FAM (Vvactin) pour les standards présentent des phases linéaires de pente faible (Fig. 37).

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Figure 37: Comparaison des profils d’amplification obtenus avec Vvactin en 1-plexe et en 3-plexe. Les courbes d’amplifications ont été obtenues avec la solution standard à 104 copies en 1-plexe (jaune), en 3-plexe sans les amorces non-marquées pour les couples fongiques (TAMRA, ROX), et en condition 3-plexe usuelle.

Ce phénomène n’étant pas observé pour les profils associés aux échantillons (A Fig. 5), il est probablement dû à une moins bonne interprétation de la fluorescence propre à FAM, lorsque l’ensemble des couples de la réaction produisent un amplicon, et que la fluorescence varie simultanément dans les trois canaux. Cette hypothèse est appuyée par le fait que ce phénomène n’est pas observé lorsque les amorces antisens relatives aux couples d’amorces fongiques ne sont pas introduites dans le milieu réactionnel (Fig. 37). Cependant, bien qu’une déviation des Ct ne semble pas être observée (Fig. 37), il est tout de même nécessaire de vérifier si ce phénomène n’induit pas de modification de quantification in fine, de par une mauvaise lecture des signaux propres à FAM lors de la calibration.

Les courbes de fusion associées à chaque couple d’amorces consistent en un pic unique (A. Fig. 3, A. Fig. 4, A. Fig. 5). Dans les contrôles négatifs pour les couples PalQ-ROX (Fig. 35A), on note la présence de produits aspécifiques associés à des amplifications tardives (inférieures à 10 copies). Toutefois, ces produits aspécifiques présentent des profils de fusion de faible amplitude, et leurs Tm sont clairement différentes de celles attendues pour un diagnostic positif avec PalQ (A. Fig. 4). De plus l’apparition tardive de ces produits n’affecte pas la gamme de quantification linéaire de la réaction pour ce couple (A. Fig. 4).

Pour Vvactin, les Tm des produits obtenus sur les standards et les échantillons de plantes sont nettement différents, avec des Tm respectives de 78,6 et 77,6 °C (+/- 0,5°C) (A. Fig. 5). Les profils observés présentant des pics uniques sur les deux types de matrices, les réactions

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peuvent être considérées comme spécifiques dans les deux cas. Cette différence de Tm est due à l’utilisation de la séquence de l’ADN complémentaire du transcrit de l’actine pour les standards. Cette variation n’a donc pas été considérée comme problématique, comme cela aurait pu l’être pour les couples d’amorces fongiques.

1.2.2. Comparaison de la mesure de la référence endogène en 1-

plexe et 3-plexe

Une comparaison de la mesure propre à Vvactin a été réalisée avec les 3-plexes (PchQ/BobQ/Vvactin) et (PalQ/BpvQ/Vvactin) dans les conditions présentées précédemment (Fig. 37), soit en 1-plexe, en 3-plexe sans amorces antisens pour les couples d’amorces fongiques, et en 3-plexe dans les conditions usuelles (Fig. 38).

Figure 38: Comparaison de la mesure de la référence endogène Vvactin en condition de 1- plexe et de 3-plexe. Les valeurs quantitatives obtenues pour 3 mesures par condition ((A) 1-plexe, (B’) et (C’) 3-plexe (PchQ/BobQ/Vvactin) et (PalQ/BobQ/Vvactin) sans amorces antisens pour les couples fongiques, (B) et (C) 3-plexe (PchQ/BobQ/Vvactin) et (PalQ/BobQ/Vvactin)) sont présentées pour 3 échantillons (1, 2, 3) ainsi que leurs moyennes. La classification obtenue par l’analyse statistique par paires sur les moyennes est indiquée par des lettres minuscules (P<0,05).

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Les résultats indiquent que des variations d’environ 30% peuvent être observées pour certains échantillons, en l’occurrence l’échantillon 3, sans pour autant l’être de manière significative dans toutes les conditions. La moyenne obtenue en condition C (3-plexe PalQ/BpvQ/Vvactin) semble légèrement supérieure à celle observée dans les autres conditions. Toutefois, aucune différence significative entre les moyennes n’est mise en évidence par le test KW (p=0,092).

Les résultats indiquent qu’une variabilité peut exister entre échantillons, et entre multiplexes. Cependant ces variabilités sont comparables à celles observées en condition de 1-plexe sur souches fongiques pures (Fig. 38), et les moyennes sur trois échantillons indépendants ne sont pas significativement différents. Ces résultats peuvent donc être la conséquence de la variabilité générale de la méthode, due au dosage des ADN extraits cumulée à l’incertitude de quantification RT-qPCR.

1.2.3. Comparaison des droites de calibration en 1-plexe et 3-plexe

3-plexe1 équation R2 Eff. (%) PchQ Y=-3,20x + 37,74 0,999 105,35

BobQ Y=-3,41x + 39,65 0,998 98,62

Vvactin Y=-3,27x + 39,37 0,999 102,21

3-plexe2 équation R2 Eff. (%) BpvQ Y=-3,21x + 37,45 0,998 104,89

PalQ Y=-3,42x + 38,22 0,998 96,06

Vvactin Y=-3,34x + 41,52 0,997 99,25

Les résultats présentés ici ont été obtenus sur des gammes de dilution au 1/10 entre 10 et 105 pour les couples d’amorces fongiques et 100 et 106 copies pour la référence endogène Vvactin.

Les droites de calibration obtenues indiquent des efficacités de réaction en 3-plexe comparables à celles observées en 1-plexe, pour tous les couples d’amorces, et les trois 3- plexes (Fig. 21, 23, 25, 27, 29, 36, Tab. 8). Cette approche confirme que le multiplexage

3-plexe3 équation R2 Eff. (%) PchQ Y=-3,39x + 37,33 0,996 97,30

PalQ Y=-3,55x + 38,29 0,992 91,45

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n’affecte pas les performances de réaction intrinsèques à chaque couple en condition de 3- plexe.

2. Validation de la spécificité des couples d’amorces sur