Evaluation de la présence d’inhibition PCR

Des tests d’inhibition ont été réalisés avec 10ng d’ADN extrait (Fig. 10). Cette quantité de matrice est similaire à celle utilisée par d’autres équipes pour l’analyse d’ADN extrait de bois de vigne par PCR (Aroca and Raposo, 2007). Les tests d’inhibitions consistent à déterminer si la solution d’ADN extraite du bois affecte la réaction PCR. Ce phénomène se traduit par une baisse de l’efficacité de réaction, et par conséquent, une augmentation de la valeur du Ct observé pour une cible en quantité connue.

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Figure 33: Evaluation de l’inhibition PCR induite par le procédé d’extraction des acides nucléiques du bois. Les profils d’amplification et de fusion ont été obtenus avec le couple PalQ-ROX. Les courbes en rouge représentent les amplifications observées sur la solution standard à 104 copies. Les courbes bleues correspondent à celles obtenues avec la même solution standard (104 copies) et 10ng d’ADN extrait du bois de vigne avec la méthode décrite.

Ces essais ont été réalisés avec le couple d’amorces (PalQ-ROX) sur les 6 extractions d’ADN présentées précédemment (Tab. 7). L’ajout de 10ng d’ADN extrait de bois de vigne n’induit pas de variation des Ct observés pour 10 000 copies de la β-tubuline de P.al (Fig. 33). Nous pouvons conclure que l’utilisation de 10ng d’ADN, extrait avec la méthode décrite, ne génère pas de phénomène d’inhibition PCR.

Par extension, la quantification absolue des ADN des espèces ciblées via une calibration réalisée sur ADN fongique ou produit PCR peut donc être réalisée sur des ADN extraits de bois.

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4.2.

Validation de la méthode sur plants inoculés

Des boutures de vigne (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) ont été utilisées afin d’évaluer la méthode sur plante. Les boutures ont été élevées en serre et prélevées 8 semaines post inoculation. Une rondelle de bois de 10 mm d’épaisseur a été prélevée 5mm au dessus de la zone d’inoculation et analysée. Dix plants par couple d’amorces (5 contrôles et 5 plants inoculés) ont été utilisés pour cet essai. Les analyses ont été réalisées en 1-plexe avec 10ng d’ADN extrait.

Figure 34: Histogramme des valeurs brutes en nombre de copies obtenues pour 10ng d’ADN extrait de plants inoculés. Les classes déterminées par l’analyse statistique sont indiquées par des lettres.

Seules les plantes inoculées avec les champignons ont été diagnostiquées positives (Fig. 34). Pour chaque condition, les produits PCR amplifiés ont présentés des profils et des températures de fusion identiques à ceux obtenus sur ADN fongique pure. Le plus faible niveau de détection a été observé pour E.lata, avec seulement un échantillon quantifiable, trois contenants des traces, et un négatif. Le faible niveau de détection observé pour E.lata est probablement dû à sa lente progression dans le bois, ainsi qu’aux conditions climatiques défavorables (chaudes et sèches) à l’installation de ce champignon lors de cet essai.

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Pour tous les autres champignons testés, des quantifications ont pu être réalisées sur les cinq plantes inoculées (Fig. 31). Les plus fortes valeurs sont observées pour P.al (2500 copies/10ng), puis pour N.pv (1300), P.ch (800) et D.se (500). De par la grande variabilité observée entre plantes d’un même lot, des différences quantitatives significatives n’ont pu être mises en évidence qu’entre peu d’espèces. E.lata est significativement différent de P.al et de N.pv alors que D.se n’est différent que de P.al. N.pv et P.al ne sont pas significativement différents entre eux (Fig. 34).

En définitive, la méthode développée permet la détection et la quantification des ADN des différents agents dans des échantillons de bois provenant de plants infectés.

5. Conclusions

L’objectif de la première partie de ce travail était de développer et de valider une procédure permettant la quantification de cinq agents associés aux maladies du bois de la vigne par RT-qPCR.

Le gène de la β-tubuline a été choisi car il est présent en nombre de copies unique et fixe par génome haploïde chez les champignons ascomycètes, contrairement aux séquences des ADN ribosomiques. Toutefois, la variabilité interspécifique de ce gène ne permet pas l’obtention de couples d’amorces théoriquement spécifiques à l’espèce pour D.se et N.pv.

Les couples d’amorces conçus permettent des performances de réaction PCR propres à leurs utilisations en RT-qPCR, soit :

-l’amplification d’un fragment PCR unique sur ADN fongique -une efficacité de réaction comprise entre 90 et 105% -une gamme de quantification linéaire

L’utilisation de souches fongiques pures a permis de confirmer les résultats prédits lors de l’analyse bioinformatique. La méthode développée permet de quantifier différentes souches d’une même espèce de manière similaire. De plus, les valeurs observées entre

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champignons sont du même ordre de grandeur, et ne sont pas significativement différentes dans de nombreux cas lors de comparaison par paires. Les masses déduites par génomes haploïdes (de 17 à 41fg) sont tout à fait cohérentes avec les masses des génomes connues chez les ascomycètes, mais ne peuvent être cependant considérées ici comme exactes. La limite de détection de la méthode est de 500fg d’ADN fongique par réaction pour les cinq champignons.

La méthode d’extraction des ADN utilisés pour le bois de vigne permet l’extraction d’environ 700ng d’ADN de 100mg de tissu sec, et ce de manière reproductible. L’utilisation de 10ng d’ADN par analyse n’induit pas de phénomène d’inhibition, et par conséquent de biais de quantification de l’ADN de ces agents dans des ADN extraits de bois de vigne.

La méthodologie ici développée permet donc une détection et une quantification absolue de ces agents dans des échantillons de bois de vigne en condition contrôlée. Il est maintenant nécessaire de déterminer si la méthode permet d’établir un diagnostic spécifique de la présence des agents ciblés dans les plants en condition de terrain.

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Chapitre IV – Validation de la méthode RT-qPCR

pour la détection et la quantification des agents

pathogènes dans le bois de jeunes plants issus de

pépinière viticole

La seconde partie de ce travail de thèse a consisté à la validation de tests RT-qPCR pour la détection et la quantification des agents pathogènes (P.ch, P.al, D.se et N.pv/N.ribis) dans le bois de jeunes plants issus de pépinière viticole.

Dans un premier temps, cinq couples d’amorces (PchQ, PalQ, BobQ, BpvQ, Vvactin) ont été évalués pour leurs utilisations dans des tests 3-plexes en technologie Plexor, d’après les performances déduites des droites de calibration. Dans un second temps, deux de ces tests 3-plexes ont été évalués sur jeunes plants en condition de terrain.

1. Développement de tests multiplexes

Le développement d’un test multiplexe permet la détection simultanée de plusieurs agents pathogènes dans une même réaction. Elle permet donc une réduction des coûts et des temps d’analyse, et l’introduction d’un contrôle positif dans chaque réaction sous la forme d’une référence endogène. L’introduction d’un couple d’amorce amplifiant le matériel végétal, en l’occurrence le gène nucléaire de l’actine 1 de vigne (Vvactin) a donc été réalisée dans ces tests 3-plexes. Les performances individuelles de chaque couple ont été comparées en condition de 1-plexe et de 3-plexe (deux couples d’amorces fongiques (TAMRA et ROX) + Vvactin FAM).

1.1.

Détermination des performances du couple

d’amorces associé à la référence endogène (Vvactin)

Le couple d’amorces choisi ici comme référence endogène cible une séquence du chromosome 8 chez les espèces séquencées du genre Vitis (Reid et al., 2006). Celle-ci

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correspondant au gène de l’actine 1, et est appelé ici Vvactin. Les amorces VvactinF et VvactinR ont des tailles de 22 et 23 nucléotides et produisent un fragment PCR de 178 pb sur ADN génomique.

Figure 35: Gamme de quantification linéaire et efficacité du couple d’amorce VvactinF- FAM/VvactinR. Les droites de régression linéaire présentées ont été obtenues sur les gammes de dilution au 1/10 de produits PCR (Fig. 36). L’équation de la droite de régression ainsi que les valeurs R2 et l’efficacité sont reportées en haut à droite du graphique.

Figure 36: Profils d’amplification et de fusion des produits du couple Vvactin-FAM en technologie Plexor. Le panneau supérieur représente les profils d’amplification obtenus sur la gamme de produits PCR d’actine de vigne au 1/10 (102 à 106 copies). Les profils de fusion des produits respectifs sont représentés dans le panneau inférieur. Les profils obtenus pour le calcul de la droite standard sont représentés en bleu, et le profil obtenu pour le contrôle négatif en vert.

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L’efficacité de réaction observée pour VVactin-FAM est comparable aux autres couples présentés précédemment (Fig. 21, 23, 25, 27, 29 et 35). La droite de calibration obtenue entre 102 et 106 copies présente un R2 supérieur à 0,990 et indique une efficacité de réaction d’environ 95% (93,76%).

Les amplifications obtenues présentent des profils typiques de courbes de RT-qPCR (Fig. 18). Les profils de fusion indiquent l’amplification d’un produit PCR unique sur ADN génomique de vigne et produit PCR (actine). La Tm des produits PCR obtenus est de 78,7°C (+/- 0,5°C). Aucune amplification n’est observée dans le contrôle négatif (H2O).

1.2.

Développement de tests 3-plexes

Trois tests 3-plexes, contenant deux couples d’amorces associés aux champignons et la référence interne ont été évalués :

o PchQ-TAMRA / PalQ-ROX / Vvactin-FAM o PchQ-TAMRA / BobQ-ROX / Vvactin-FAM o BpvQ-TAMRA / PalQ-ROX / Vvactin-FAM

1.2.1. Comparaison des profils d’amplification et de fusion en 1-