181
1. Introduction
Dans ce chapitre nous allons affiner le protocole développé précédemment dans diverses situations susceptibles d’être rencontrées lors de la caractérisation de membranes ou de modules membranaires.
Dans une première partie afin de conforter le choix du virus utilisé lors du test établi dans le chapitre précédent, une suspension de phages Q a été filtrée dans les mêmes conditions opératoires que les phages MS2 (membrane A).
Dans une seconde partie le comportement des bactériophages filtrés sur diverses membranes a été étudié. Le même mode de filtration tangentiel a été utilisé pour toutes les membranes. Des membranes de différents matériaux (polysulfone et PVDF), tailles de pores et sens de filtration ont été étudiées. Leurs seuils de coupure déterminés par la mesure de rétention de traceurs (PEG/PEO et dextranes) ont été comparés aux abattements en phages MS2 obtenus dans les mêmes conditions opératoires.
Dans une troisième partie, la sensibilité de notre protocole a été vérifiée lorsqu’une fibre parmi 15 contenues dans un module présente un trou traversant de 25 m (membrane A). Les différentes méthodes de caractérisation disponibles telles que la mesure de perméabilité, du seuil de coupure ont été comparées à la détermination du LRV. Puis selon un modèle des phénomènes de transfert, un abattement a été calculé et comparé à l’abattement expérimental obtenu.
Dans une dernière partie, des essais réalisés sur pilote industriel au sein de l’entreprise Aquasource sont présentés. Ceci nous a permis d’évaluer le protocole à une échelle supérieure de celle des micro-modules du laboratoire. Les essais effectués chez l’entreprise Polymem sont regroupés en annexe 8, étant donné la nécessité de résultats complémentaires pour valider nos premières expériences.
182
2. Comparaison du comportement en filtration des bactériophages
MS2 et Q
Langlet et al. ont montré que la rétention des bactériophages MS2 et Q de tailles identiques pouvait être différente lorsqu’une filtration sur membrane est effectuée dans les mêmes conditions opératoires [3]. Il nous est alors apparu nécessaire d’effectuer une étude comparative afin de déterminer dans le cas de l’application du protocole défini dans le chapitre IV et en utilisant toujours la membrane A, quel est le meilleur traceur pour caractériser la rétention de cette membrane. Le « pire cas » est recherché, pour cela le phage devra transférer à travers la membrane le plus facilement possible dans nos conditions opératoires.
Etant donné que la présence de phages Q détériorés a été observée dans une gamme de concentration en NaCl beaucoup plus large (inférieur à 8 g/L NaCl) que pour les MS2 (inférieur à 5 g/L NaCl), nous avons choisi de filtrer des suspensions de phages Q préparées dans le PBS et l’eau du réseau.
2.1. Prise en compte de l’adsorption
De la même façon qu’avec les phages MS2, l’adsorption sur le système de filtration a été quantifiée lorsqu’une suspension de phages Qdans de l’eau du réseau ou du PBS est filtrée sur un module membranaire de référence A. La figure V.1 présente et compare l’évolution des concentrations en ARN viraux totaux de MS2 et Q dans le rétentat au cours du temps dans les deux milieux. Les concentrations en ARN viraux totaux de Qet MS2 dans le rétentat suivent la même tendance, la diminution observée reste acceptable pour notre étude, inférieure à 1 Log10.
183
Figure V.1. Evolution des concentrations dans le rétentat en ARN viraux totaux de MS2 et Q
en équivalent UFP/mL (RT-PCR avec extraction) pendant 2 heures avec « dopage » à 15 minutes dans différents solvants (eau du réseau et PBS). Un prélèvement de la suspension est effectué à la sortie du rétentat. Cx/C0 est le rapport de la quantité d’ARN viraux totaux de MS2 (ou Q au
temps x sur la quantité d’ARN viraux totaux de MS2 (ou Q au temps 0 (le titre initial étant de 1.108 UFP/mL), n>2.
2.2. Choix de la durée du test de filtration
Les courbes des concentrations dans le rétentat en phages infectieux correspondant à la filtration des phages MS2 sont reportées sur la figure V.2 (chapitre IV), pour être comparées à celles obtenues avec les phages Q
Figure V.2. Evolution des concentrations dans le rétentat en virus MS2 et Q infectieux en UFP/mL (UFP) pendant 4 heures après « dopage » dans différents solvant (eau du réseau et PBS). Un prélèvement de la suspension est effectué à la sortie du rétentat. Cx/C0 est le rapport
de la quantité des virus MS2 (ou Q infectieux au temps x sur la quantité d’ARN viraux totaux de MS2 (ou Q au temps 0 (le titre initial étant de 1.108 UFP/mL), n>2.
-2 -1 0 1 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Lo g10 (Cx /C0 ) Temps (min)
Cr (ARN viraux totaux de MS2) - eau du réseau Cr (ARN viraux totaux de MS2) - PBS
Cr (ARN viraux totaux de Qbéta) - eau du réseau Cr (ARN viraux totaux de Qbéta) - PBS
Dopage y = -0.0154x + 0.3678 R² = 0.9678 y = -0.1704x + 0.1792 R² = 0.973 y = -0.0165x + 0.1448 R² = 0.9699 y = -0.1322x - 2.0738 R² = 0.7527 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 Lo g10 (Cx /C0 ) Temps (min)
Cr (virus Qbéta infectieux) - eau du réseau Cr (virus Qbéta infectieux) - PBS
Cr (virus MS2 infectieux) - eau du réseau Cr (virus MS2 infectieux) - PBS
184
De la même manière que les phages MS2, les phages Q perdent de leur infectivité en cours de filtration, ceci d’autant plus que la force ionique de la suspension augmente.
La durée du test sur laquelle la perte d’infectivité est limitée à 1 Log10 doit alors être
définie de la même manière que précédemment (tableau V.1).
Phages Quantification Coefficient de vitesse ai (s-1) dfiltration (min)
MS2 Inactivation avec dopage à 15 min (eau du réseau) Inactivation avec dopage à 15 min (PBS)
27,5 10-5
220 10-5 -2,07 0,14 61 - Q Inactivation avec dopage à 15 min (eau du réseau)
Inactivation avec dopage à 15 min (PBS)
25,7 10-5
284 10-5 0,37 0,18 65 6
Tableau V.1. Détermination des coefficients d’inactivation ai (s-1) et de dfiltration (min), temps
à partir duquel la concentration en phages MS2 ou Q infectieux a diminué de 1 Log10,
lorsque la suspension de phages est préparée dans différents solvants.
Les coefficients de vitesse d’inactivation ai pour chaque solvant restent dans le même
ordre de grandeur pour les deux phages. La durée du test de filtration, déterminée par dfiltration, est identique lorsque les phages MS2 et Q sont filtrés dans l’eau du
réseau (respectivement 61 et 65 minutes). Dans le PBS, même si la perte en phages infectieux à t0 est négligeable pour les phages Q (Log10 (Cx/C0) supérieur à -1) par
rapport aux phages MS2 (égal à -2,07), le calcul de dfiltration montre cependant que la
durée pour laquelle la concentration en phages Q infectieux a diminué de moins de 1 Log10 reste très faible (6 minutes). Ainsi, comme pour les phages MS2, nous ne
déterminerons pas d’abattement en phages infectieux lorsque les phages Q sont dilués dans le PBS, une durée d’au moins 10 minutes après dopage étant jugée nécessaire afin de réaliser des tests valables (chapitre II.6.1).
2.3. Détermination et comparaison des LRV
La figure V.3 présente les concentrations des perméats et des rétentats des phages Q au cours de plusieurs filtrations effectuées sur un module membranaire A lorsque les phages sont dilués dans de l’eau du réseau ou du PBS.