3.1. Caractérisation chimique des margines brutes
Les analyses chimiques des margines sont été réalisées selon les normes décrites par l’AOAC, (1990 ; 14, method ID 942.05). Toutes les analyses ont été effectuées en triple.
(%) * ' ] [ * 14 * ) )( ( MS essai d prise HCl ml HCl vol N
3.1.1. Détermination de la matière sèche
Elle a été déterminée par dessiccation dans une étuve ventilée jusqu’à poids constant. 10 ml de margines ont été introduit dans un cristallisoir préalablement taré. Ce dernier a été placé dans une étuve à 80°C pendant 48 heures (jusqu’à poids constant). La différence de poids correspond à la perte d’humidité et le résidu caractérise la teneur en matière sèche de l’échantillon.
3.1.2. Détermination de la matière minérale
Les margines préalablement séchées ont été incinérées dans un four à moufle à 550 °C pendant 6 heures. La perte de poids observée au cours de la calcination correspond à la matière organique et le résidu aux cendres (matière minérale).
3.1.3. Détermination de la matière azotée totale
L’azote total est dosé par la méthode de Kjeldahl. Cette méthode comporte deux étapes : la minéralisation et la distillation. L’azote organique de l’échantillon de margine sèche (prise d’essai 1g) est transformé en azote minéral (sulfate d’ammonium), en présence d’acide sulfurique concentré à chaud (20 ml H2SO4 à 420°C pendant 4 heures) et d’un catalyseur (sélénium). Après transformation du sulfate d’ammonium en ammoniac par une base forte (NaOH ; 10N), l’ammoniac est entraîné par la vapeur d’eau et repris dans une solution d’acide borique contenant un indicateur coloré. Il est alors titré par une solution d’HCl ; 0,1N. Les étapes de distillation et de titration sont réalisées sur un autoanalyseur (KJELTEC 1030). La teneur en azote de la matière sèche est obtenue par l’équation suivante :
La teneur en matières azotées totales (MAT) est obtenue en multipliant la teneur en azote N par le coefficient 6,25.
3.1.4. Dosage des sucres totaux
Le dosage des sucres totaux est réalisé selon la technique de Dubois et al. (1956). Le mélange réactionnel est composé de 1 ml de margine, 1 ml d’une solution de phénol (5%, P/V dans l’eau) et 3 ml d’acide sulfurique (97%). Les tubes sont agités vigoureusement au vortex puis incubés pendant 30 min à 30°C. L’absorbance est mesurée à 488 nm. Les concentrations en
y = 11,385x R2 = 0,9997 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Concentration en glucose (mg/ml) A b s o rb a n c e
sucres totaux sont déduites à partir d’une courbe d’étalonnage de glucose (figure 15). La teneur en sucres totaux est exprimée en pourcentage de MS.
Figure 15 : Courbe étalon des sucres totaux
3.2. Evaluation de la biodégradation des margines brutes par les
microorganismes du rumen via la production des biogaz (voie biologique)
L’assimilation des margines brutes par le microbiote du rumen a été réalisée in vitro par le procédé expérimental décrit par Menke et al. (1979) avec quelques modifications. Ce procédé est une simulation de la dégradation des aliments par les microorganismes dans le rumen dont le principe se base sur la mesure de la production de biogaz, méthane (CH4) et gaz carbonique (CO2), qui sont les gaz fermentaires essentiellement produits lors de la dégradation microbienne.
3.2.1. Description du système de fermentation en batch (seringue)
La fermentation est réalisée dans des seringues en polypropylène de 60 ml dont le bout a été connecté à un tube en silicone et fermé par une pince pour éviter la perte des gaz produits pendant la fermentation. Les pistons des seringues sont lubrifiés avec de la graisse de silicone. La biodégradation in vitro des margines est suivie par la lecture du volume de biogaz produit, indiqué par le déplacement du piston.
3.2.2. Inoculum
Le jus de rumen, utilisé comme inoculum, est prélevé de 3 moutons, accoutumés munis d’une canule ruminale. Il est transféré dans des thermos préalablement chauffés à 39 °C et
saturés en CO2. Au laboratoire, le contenu ruminal est filtré à travers 4 couches d’un tissu de mousseline. Toute la manipulation est réalisée sous un flux constant de CO2.
3.2.3. Composition du milieu de culture
Le milieu de culture est composé d’une solution tampon (NaHCO3, 35,0 g/l), d’une solution de macrominéraux (Na2HPO4, 5,7g ; KH2PO4, 6,2g ; MgSO4.7H2O, 0,6g ; q.s.p. 100 ml), d’une solution d’oligo-éléments (CaCl2.2H2O, 3,2g ; MnCl2.4H2O 10,0g ; CoCl2.6H2O, 1,0g ; FeCl2.6H2O, 8,0g ; q.s.p. 100 ml), d’un indicateur du potentiel d’oxydoréduction (résazurine (C12H6NO4), 0,1g ; q.s.p. 100 ml) et d’une solution réductrice (NaOH (1N), 4 ml ; Na2S.9H2O, 625 mg; H2O, 95 ml). Le mélange de couleur bleue est chauffé jusqu’à virage de la couleur vers le rose. Ensuite, la solution est barbotée avec un flux continu de CO2, ce qui entraîne la réduction de la salive artificielle indiquée par le virage de la couleur du rose au blanc transparent. A cette étape, le jus de rumen filtré est ajouté dans les proportions 1/2 (v/v). Enfin, un barbotage en surface est maintenu pendant 10 min de manière à maintenir une atmosphère totalement anaérobie.
3.2.4. Inoculation et incubation
Duex cent (200) mg de margines brutes ont été introduits dans chaque seringue et mis à fermenter avec 30 ml de milieu de culture (10 ml de jus de rumen filtré et 20 ml de la salive artificielle). Pour chaque série d’incubation, trois répétitions ont été réalisées. Dans les mêmes conditions, trois témoins (jus de rumen et salive artificielle) sont incubés. Les seringues inoculées sont incubées dans des bains marie réglés à 39°C et agités d’une manière cyclique de 3 min (30 secondes agitation, et 2 minutes et 30 secondes sans agitation).
3.2.5. Paramètres fermentaires mesurés
3.2.5.1. Mesure du pH
Le pH des jus de rumen et des contenus des fermenteurs est déterminé à l’aide d’un pH-mètre (HANNA Instruments HI 8418).
3.2.5.2. Production de biogaz
Le suivi de la cinétique de fermentation est réalisé par la mesure du volume des biogaz à différents intervalles de temps : 3, 6, 9, 24, 48, 72 et 96 heures. De la production de biogaz après 24h d’incubations et des concentrations des composés nutritifs (protéines totales et les matières
minérales) sont estimés les paramètres suivants : l’énergie métabolisable, la digestibilité de la matière organique et la production des AGV selon les équations de régression proposées par Menke et Steingass (1988) et Getachew et al. (2000) :
In vitro OMD (g/kg MS) =14.88 + 0.889GPT + 0.45CP + 0.0651XA
In vitro ME (MJ/kg MS) = 2.20 + 0.136GPT + 0.057CP +0.029CP2
et Acides Gras Volatils AGV (µmole/g MS)= 0.0239GPT- 0.0601
Avec OMD, digestibilité de la matière organique (g/100 g MS); ME, énergie métabolisable (MJ/kg MS); GPT, volume de biogaz enregistré après 24h de fermentation ; CP, contenu en protéines totales (g/100 gr MS); XA, contenu en cendres (g/100 g MS).