L’emploi du système CRISPR/Cas9 de type nickase pour générer les cassures double-brin de l’ADN implique l’hybridation de deux ARN guides sur des segments génomiques différents, de part et d’autre de la cible à recombiner. Nous avons procédé à l’identification des ARN guides les plus performants pour cibler l’exon 7 du gène
AGXT (E7AGXT) à l’aide du programme CHOPCHOP409 (Tableau 6).
Guide RNA Sequence
#24 5’-GGGAGTACATCTTCTTTCTG-3'
#25 5’-AGGAGAAGGGCTTCGTCTTG-3’
#26 5’-GACGACCAGCCCAGGATGTG-3’
Tableau 6. Séquences des ARN guides ciblant l’exon 7 du gène AGXT. Les ARN guides 24 et 25 s’hybrident en 5’ de la mutation c.731T>C, tandis que l’ARN guide 26 s’hybride en 3’. Les numéros correspondent à des références attribuées par le programme CHOPCHOP.
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L’efficacité de ciblage des ARN guides, qui consiste en leur capacité à guider la protéine Cas9 vers une région génomique déterminée, a ensuite été évaluée par l’intermédiaire de l’apparition d’indels résultant de la réparation des cassures double- brin de l’ADN par NHEJ. Nous avons pour cela imaginé un système rapporteur, intégré dans une lignée HEK293T, permettant de détecter les décalages du cadre de lecture provoqués par la création d’indels au niveau de l’exon 7 du gène AGXT via l’arrêt de la synthèse de la protéine eGFP (Figure 38). Grâce à ce système, une simple analyse cytométrique de fluorescence permet d’extrapoler la capacité des ARN guides à mener la protéine Cas9 au site cible de clivage. Il faut noter que dans cette étude, la nécessité d’évaluer la performance individuelle de chaque ARN guide implique l’utilisation d’une nucléase pour réaliser les cassures double-brin de l’ADN.
Figure 38. Représentation schématique du fonctionnement du système rapporteur destiné à l’évaluation de l’efficacité de ciblage des ARN guides sur l’exon 7 du gène AGXT. La mise en fusion de la cible E7AGXT avec la séquence d’ADN complémentaire de l’eGFP (séquence E7AGXTeGFP) implique une corrélation directe entre la synthèse de cette protéine et l’intégrité du cadre de lecture de l’exon 7 du gène AGXT. Après clivage de la cible E7AGXT par le système CRISPR/Cas9 nucléase, la survenue d’un décalage du cadre de lecture suite à une réparation non fidèle de la cassure se traduit par un arrêt de la synthèse de l’eGFP détectable par cytométrie en flux. Abréviations : Cas, CRISPR-
associated protein ; cDNA, ADN complémentaire ; CRISPR, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ; eGFP, enhanced Green Fluorescent Protein ; E7 AGXT, exon 7 du gène AGXT ; indels,
insertions/délétions.
Pour créer le système rapporteur, nous avons développé deux outils distincts : un vecteur d’expression de la Cas9 nucléase et des ARN guides, et une lignée cellulaire HEK293T exprimant la cassette de fusion E7AGXTeGFP.
Le vecteur d’expression du système CRISPR/Cas9 nucléase correspond au plasmide pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (pX330) (#42230, Addgene), au sein duquel ont été insérés les ARN guides à tester (une séquence par plasmide) ainsi que le gène de résistance à la puromycine dérivé du vecteur pSpCas9n(BB)-2A-Puro V2.0 (pX462) (#62987, Addgene).
La lignée cellulaire HEK293T exprimant la séquence E7AGXTeGFP a été générée selon les étapes suivantes :
1) la séquence de fusion E7AGXTeGFP a été créée par une succession d’amplifications génomiques par PCR (Polymerase Chain Reaction) et introduite à l’aide
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des enzymes BamHI et SalI en remplacement de la séquence d’expression de l’eGFP sauvage dans le plasmide de transfert lentiviral « p16 » développé par la plateforme de vectorologie de l’Université de Bordeaux (Figure 39),
2) un vecteur lentiviral exprimant la séquence de fusion E7AGXTeGFP (LV- E7AGXTeGFP) a été produit par transfection de cellules HEK293T au phosphate de calcium en présence du plasmide de transfert p16, et des plasmides d’empaquetage (porteur des gènes GAG et POL) et d’enveloppe (porteur de la séquence VSV-G exprimant la glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire),
3) le vecteur LV-E7AGXTeGFP produit a finalement été employé pour transduire de nouvelles cellules HEK293T de façon à intégrer une copie de vecteur par cellule (lignée HEK-E7AGXTeGFP).
Figure 39. Représentation schématique de la structure du plasmide de transfert lentiviral p16 exprimant la cassette de fusion E7AGXTeGFP. Seule la partie intégrée dans les cellules HEK293T a été représentée. Abréviations : cDNA, ADN complémentaire ; eGFP, enhanced Green Fluorescent Protein ; E7 AGXT, exon 7 du gène AGXT ; LTR, Long Terminal Repeats ; MNDp, promoteur ubiquitaire MND ; WPRE, Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element.
Dans l’objectif de nous assurer de l’homogénéité des résultats obtenus, nous avons réalisé un sous-clonage de la lignée HEK-E7AGXTeGFP, et nous avons sélectionné un clone présentant une fluorescence eGFP maximale. 500 000 cellules de ce clone ont été transfectées au phosphate de calcium avec 5 µg de plasmide pX330 exprimant la Cas9 nucléase seule ou associée à un ARN guide. Les cellules transfectées ont été sélectionnées en présence de puromycine et leur florescence a été analysée par cytométrie en flux (Figure 40).
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Figure 40. Analyse de la fluorescence des cellules HEK293T par cytométrie en flux. La condition « pX330 » correspond à l’expression de la Cas9 nucléase seule, tandis que les conditions « pX330-24, -25 et -26 » correspondent à l’expression de la Cas9 nucléase associée aux ARN guides 24, 25 et 26 respectivement. Ce graphique est le résultat de trois analyses indépendantes. Abréviations : eGFP,
enhanced Green Fluorescent Protein ; E7 AGXT, exon 7 du gène AGXT ; HEK, Human Embryonic Kidney ;
NT, Non-Transfected; WT, Wild-Type.
Les analyses réalisées par cytométrie en flux montrent une efficacité de ciblage satisfaisante des trois ARN guides étudiés, s’illustrant par une diminution de 70 à 90% de la fluorescence des cellules transfectées. Ces résultats sont en outre potentiellement sous-estimés par l’incapacité du système rapporteur à détecter les événements de clivage réparés de façon fidèle à la séquence d’origine ou n’entraînant pas de décalage du cadre de lecture. Dans ces conditions, nous avons choisi de conserver l’ensemble des ARN guides testés pour la poursuite de nos expériences de recombinaison.