I. Introduction
I.3. Utilisation des nanodisques pour l’étude de protéines membranaires
I.3.3. Etudes structurales
Des essais d’utilisation des nanodisques en biologie structurale ont été réalisés avec les trois méthodes principales à haute résolution que sont la résonance magnétique nucléaire, la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique.
49
Protéines Techniques Assemblage Résolution Année Références
Microscopie électronique
ZipA Negative staining Assemblage direct 2012 113
Anthrax toxin pore Negative staining Assemblage direct 22A 2010 118
anthrax
toxin translocon Cryo microscopie électronique Assemblage direct 16A 2013
119
KcsA Coloration négative Assemblage direct 2014 120
Integrin αIIbβ3 Coloration négative Assemblage direct 20A 2013 121
Bax Cryo EM Assemblage direct 25-30A 2013 122
Nanodisques vides Cryo-EM Assemblage directe 2016 123
Résonance magnétique nucléaire
VDAC-2 RMN en solution Assemblage direct Comparaison
spectres 2012
124
Nanodisques vide RMN en solution Assemblage direct 2013 125
Nanodisques vides RMN en solution Assemblage direct 2010 126
Fragment de la protéine CD4
RMN en solution Assemblage direct 2009 127
50
BCL-XL RMN en solution Assemblage direct 2015 129
Nanodisques seuls RMN du solide Assemblage direct 2006 82
Cristallographie
Nanodisques vide Cristallogénèse Assemblage direct Cristaux 79
Spectroscopie de force atomique
Bacteriorhodopsin Assemblage direct 2012 103
SANS/SAXS
Nanodisques vide SANS/SAXS Assemblage direct 2014 130
Bacteriorhodopsin SANS/SAXS Assemblage direct 2014 131
Nanodisque vide SAXS Assemblage direct 2015 132
51 3.3.a Etudes à l'aide de la résonance magnétique nucléaire
Dans une étude de l'équipe de Hiller, les spectres RMN de la protéine membranaire VDAC-2 en détergent LDAO et en nanodisques sont parfaitement superposables (Figure I-18). Cela démontre la faisabilité d'étude de protéines membranaires en nanodisques par cette approche124.
Un des problèmes pour la résolution de structures par RMN est la taille des nanodisques qui vont entrainer un temps de relaxation important. Par conséquent, l’interprétation des spectres est difficile, à cause du chevauchement des tâches de corrélation.
Pour remédier à cela, différentes troncations de la protéine MSP1 ont été réalisées par deux équipes de manière simultanée, afin de réduire la taille des nanodisques133,125.
52 La stabilité des nanodisques formés avec les protéines d’assemblages tronquées est variable contribuant au fait que ces améliorations n'ont pas encore permis de résoudre une structure de protéine membranaire en nanodisques.
La RMN du solide pour le moment permet d'avoir des spectres de nanodisques vides mais aucune structure n'a été publiée82.
3.3.b Etudes structurales à l'aide de la cristallographie
Obtenir une structure cristallographique d'une protéine membranaire incorporée dans des nanodisques représente un challenge audacieux.
Pour atteindre cet objectif avec la cristallisation en diffusion de vapeur, il faut résoudre de nombreux problèmes. Le premier est l'hétérogénéité des nanodisques. Les variations faibles de tailles des nanodisques sont un obstacle à la cristallisation. D'autre part, les rendements souvent faibles de la reconstitution en nanodisques sont aussi limitant. Enfin, la présence de la membrane lipidique peut entraîner aussi une dynamique de la protéine dans la membrane impropre à la cristallisation.
Les seuls cristaux de nanodisques sans protéine membranaire incorporée décrits dans la littérature79 sont l’œuvre de l'équipe de Craig D Blanchette, qui après avoir montré
l'existence de plusieurs tailles de nanodisques dans le pic d'une chromatographie d'exclusion de taille, a réussi à améliorer des cristaux après avoir fait une deuxième chromatographie. Cette équipe a montré une corrélation entre l’homogénéité des nanodisques et la qualité des cristaux obtenus.
Pour la méthode de cristallisation de protéines membranaires avec la phase cubique de lipides, l’équipe de V. Gordeliy (IBS, communication personnelle) a réussi à cristalliser la bactériorhodopsine à partir de protéine incorporée en nanodisques. Les nanodisques ayant incorporé la bactériorhodopsine sont mélangé avec les lipides en phase cubique, en utilisant le même protocole que pour les protéines en détergents. On peut supposer que les nanodisques permettent de sélectionner les protéines membranaires qui
53 peuvent correctement s’insérer dans la membrane lipidique et donc être correctement repliées. De ce fait, moins de protéines incorrectement repliées peuvent perturber le réseau cristallin.
3.3.c Etudes structurales à l'aide de la microscopie électronique
Cette méthode demeure celle ayant connu le plus de succès lors de la résolution de structures de protéines membranaires incorporées dans les nanodisques. Des structures de grands complexes incorporés dans des nanodisques ont été résolues grâce à cette méthode. La première structure résolue est celle de la porine de l'anthrax, avec des images prises en coloration négative118. Deux conformations du pore de l’anthrax ont pu
être déterminées à une résolution de 22 Å. Une autre structure résolue, est le complexe Sec-YEG, avec des clichés pris en cryo-microscopie électronique (Figure I-19)134. La
résolution obtenue est de 7,1 Å.
Figure I-19 : Reconstitution du complexe SecYE avec des images de Cryo-microscopie électronique.134
Grâce à la résolution de la structure en nanodisques, des interactions entre la membrane et le complexe SecYE ont été mis en évidence. Il est aussi intéressant de noter que les images de microscopie n’ont pas permis d’avoir une bonne résolution de la partie nanodisques à cause de leur hétérogénéité.
54 Le translocon est la seule structure obtenue de protéine membranaire incorporée dans des nanodisques à une résolution en dessous du nanomètre. Pour résoudre cette structure les particules ont été alignées grâce aux ribosomes, ce qui permet de s'affranchir du problème lié à l'hétérogénéité des nanodisques. A l'inverse, dans le cas de protéine membranaires qui ont un domaine transmembranaire de petite taille, il n'y a pas eu de structure résolu grâce aux nanodisques. Pour la protéine ZipA, des clichés de microscopie électronique ont été réalisés et une reconstruction a été réalisée. Une densité correspondant à la protéine ZipA est observable mais la structure n'est pas observable. De la même façon, la reconstruction de la protéine Bax permet de mettre en évidence la présence de la protéine dans les nanodisques mais ne permet pas de déterminer la structure de la protéine.