Effet de la présence de métaux sur la stabilité de MSP1

La protéine MSP1 est conservée dans un tampon contenant du TrisHCl pour maintenir le pH à 7,4, du sel et de l’EDTA. Il a été observé que lorsque la protéine est placée dans un tampon sans EDTA, la protéine forme une suspension blanchâtre qui ne sédimente pas au fond du tube.

77 Après une incubation toute la nuit dans le tampon sans EDTA, la protéine est principalement dans le volume mort de la chromatographie d’exclusion de taille (Figure III-5A, courbe noire). À titre de comparaison, il n’y a pas de pic dans le volume mort sur le profil d’élution de la protéine MSP1 dans un tampon avec EDTA. (Figure III-5A, courbe rouge) La microscopie électronique montre que la protéine forme une structure sphérique d’environ 40nm (Figure III-5B).

Deux techniques ont ensuite été mises en œuvre afin d’évaluer la stabilité de la protéine MSP1 purifiée, et les effets des métaux sur celle-ci. Des expériences de calorimétrie différentielle à balayage (DSC : Differential Scanning Calorimetry) et de fluorescence des tryptophanesen fonction de la température ont été réalisées. Ces deux méthodes ont l’avantage de ne pas nécessiter de marquage spécifique de la protéine. Les expériences de DSC sont réalisées en comparant la chaleur dégagée dans la cellule contenant la protéine avec la chaleur dégagée par le tampon seul lors de la variation de température. En se dépliant, ou lorsque un complexe se dissocie, un dégagement de chaleur à lieu. En déterminant la température qui correspond au maximum de la chaleur dégagé, on obtient la température de fusion de la protéine.

Figure III-5 : Observation de particules de 40nm en l’absence d’EDTA A. Chromatographie d’exclusion de taille de la protéine MSP1 après incubation toute la nuit dans un tampon sans EDTA, en rouge la protéine MSP1 contrôle, en noir la protéine MSP1 incubée durant la nuit dans un tampon sans EDTA.

B. Image de microscopie électronique en coloration négative (SST) du pic d’agrégat de la chromatographie en A, tracé noir

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Figure III-6 : Etude de la stabilité de la protéine MSP1 A. Fluorescence des tryptophanes (λex 295nm), le graphique représente le ratio entre la fluorescence à 360nm et la fluorescence à 320nm en fonction de la température (°C). En orange, variation de la température croissante, en rouge, variation de la température

décroissante. B.. Calorimétrie différentielle à balayage faite avec la protéine MSP1 à une concentration de 1mg/mL, en abscisse la température (°C), en ordonnée la chaleur émise, la courbe noir correspond à la

mesure avec le tampon seul, la courbe rouge correspond à la mesure de la protéine MSP1.

Un dégagement de chaleur est mesuré à partir de 40°C pour atteindre un maximum à 97°C (

Figure III-6B). Le profil obtenu avec cette protéine MSP1 est très différentes de celui

obtenu avec la protéine apolipoprotéine A1138 _{(température de transition est de 52-}

53°C). La protéine MSP1 semble beaucoup plus stable que l’apolipoprotéine A1. Afin de déterminer si la protéine n'a pas précipité pendant l'expérience, l'échantillon contenu dans la chambre expérimentale a été récupéré et la quantité de protéine, après centrifugation pour culoter les éventuels agrégats, a été mesurée. La différence de concentration entre le début et la fin de l’expérience est d’environ 10%. La protéine est donc suffisamment résistante à la température pour que le changement de conformation observé par fluorescence en augmentant la température soit réversible.

La courbe de fluorescence des tryptophanes ne semble pas montrer une transition nette (

79 Figure III-6A). Afin de voir si la protéine peut se replier, la protéine a été incubée à 100°C

pendant 20min puis la fluorescence des tryptophanes a été mesurée tous les degrés jusqu’à 20°C. A 20°C la protéine retrouve la même intensité de fluorescence que lors de l’expérience précédente à 20°C, et le même ratio 320nm/360nm.

Pour les deux expériences, il semble que la protéine ne s’agrège pas avec la température. De plus, la mesure de la fluorescence des tryptophanes en fonction de la décroissance de la température indique que la protéine retrouve sa conformation d’origine, ce qui indique que la protéine n’a pas précipité. La protéine est donc extrêmement stable à haute température. Cela a été mis à profit lors de la purification de la protéine. (annexe Figure 2)

Afin d’avoir une méthode permettant d’estimer un effet des métaux sur la stabilité des protéines d’assemblages, une approche de dénaturation à l’urée a été envisagée.

Le suivi de la dénaturation à l'urée consiste à mesurer la fluorescence des tryptophanes des protéines en ajoutant de l'urée. L'urée va dénaturer la protéine et par conséquent les tryptophanes de la protéine seront exposés au solvant, ce qui va modifier la fluorescence de ces derniers.

80 Les deux courbes de dénaturation avec et sans calcium sont superposables (Figure III-7B), ce qui indique que la présence du calcium n'influe pas sur la résistance à l'urée de la protéine. Ce résultat est en faveur de l'hypothèse selon laquelle la stabilité n'est pas modifiée par le calcium mais que celui-ci joue un rôle dans l'oligomérisation des protéines d'assemblage des nanodisques.

Nos résultats ont montré que les protéines d'assemblages sont très stables. En revanche, les ions divalents interagissent, directement ou indirectement, avec les MSP et jouent un rôle dans l'oligomérisation de celles-ci. On peut supposer que le calcium favorise les interactions protéine-protéine entre les apolipoprotéines. Une meilleure compréhension de ces interactions est primordiale pour améliorer l'assemblage des nanodisques.