Etude de YedZ

II.3.1. Purification de YedZ

La purification de la protéine est réalisée à partir de préparation de membranes issues de cultures de BL21 sur-exprimant YedZ, protéine fusionnée à une étiquette Histidine en C-terminal. Les membranes sont préparées par Céline Jullian-Binard, technicienne de l’équipe.

La quantité de protéines totales contenue dans les membranes est dosée en utilisant la technique BCA (bicinchoninic acid assay). Les membranes sont alors diluées à 2 mg/mL avec du tampon A1 (TrisHCl 50mM pH8), incubées à 4 °C durant 30 min, puis solubilisées en ajoutant du Cymal-5 (Anatrace), pour atteindre une concentration de 22,4 mM (20 mM au-dessus de la cmc).

64 Les membranes solubilisées sont centrifugées à 257000g, à 4 °C pendant 30 min. Le surnageant est récupéré et concentré par ultrafiltration (Amicon MWCO 30 kDa) jusqu'à un volume de 5 mL. De l'imidazole et des sels sont alors ajoutés (5 mL de tampon TrisHCl 50 mM, 15 mM imidazole, 150mM NaCl) dans la solution pour éviter les interactions non spécifiques avec la résine.

L'échantillon protéique est passé sur 2 mL de résine NiNTA qui a été équilibrée avec du tampon 50 mM TrisHCl, 15mM imidazole, 150mM NaCl. La résine est lavée avec 20mL de tampon 1 (50mM TrisHCl pH8, 150mM NaCl, 15mM imidazole, 4mM Cymal 5), puis avec 20mL de tampon 2 (50mM TrisHCl pH 8, 300mM NaCl, 15mM imidazole, 4mM Cymal 5), avec 20mL de tampon 3 (50mM TrisHCl pH 8, 150mM NaCl, 40mM imidazole, 4mM Cymal 5). La protéine est élué avec 10mL de tampon 4 (50mM TrisHCl pH 8, 150mM NaCl, 300mM imidazole, 4mM Cymal 5). L’élution est passée sur chromatographie d’exclusion (Superdex 200 10/300 GL) avec le tampon (50mM TrisHCl pH 8, 150mM NaCl, 4mM Cymal 5) à 4 °C et le pic correspondant à la protéine est récupéré et concentré par ultrafiltration (Amicon Ultra 50 Mw).

Une autre construction a été utilisée, avec YedZ possédant une étiquette histidine en C- terminale, fusionné avec la GFP (Green Fluorescent Protein). Une séquence de clivage avec la TEV protéase est présente entre l’étiquette histidine et la GFP. Cette protéine a été purifiée par Céline Jullian Binard.

II.3.2. Assemblage des nanodisques contenant YedZ

3.2.a Reconstitution de la protéine YedZ en Nanodiques

La reconstitution de la protéine YedZ est faite dans des nanodisques composés de lipides POPC (Avanti polar lipids). La reconstitution est réalisée comme décrit au paragraphe II.1.3., le ratio molaire de protéine YedZ, MSP1 et POPC est de 0,18/1/35. Après que le détergent ait été adsorbé par les biobeads, on obtient une solution avec des nanodisques vides et des nanodisques ayant incorporés la protéine YedZ.

La purification des nanodisques est faite avec 4 mL de résine NiNTA. La résine est équilibrée avec 2 volumes de colonne de tampon SEC (20 mM Hepes pH7,4, 100 mM

65 NaCl). La solution comprenant les nanodisques est passée trois fois par gravité sur la résine. La résine est ensuite lavée avec 5 volume de colonne respectivement avec du tampon SEC, et du tampon SEC avec 50 mM imidazole. Ces étapes permettent de se débarrasser des nanodisques vides. Les nanodisques qui ont incorporé la protéine YedZ sont élués avec un tampon SEC avec 150 mM imidazole, avec un volume correspondant à trois fois le volume de la résine. L'intégrité des nanodisques est vérifiée à l'aide d'une étape de chromatographie par exclusion de taille, soit Superdex 200 10/300, soit Superdex 200 16/60.

3.2.b Vérification de l'incorporation de la protéine YedZ

La bonne incorporation de la protéine YedZ est vérifiée grâce aux volumes d'élution obtenus par chromatographie d'exclusion de taille et par gels SDS PAGE, colorés avec du bleu de Coomassie. Pour les fractions correspondant à la taille des nanodisques par chromatographie d'exclusion de taille, la présence conjointe d'une bande ayant la masse apparente de la protéine MSP1 et d'une bande ayant la masse apparente de la protéine YedZ est une bonne indication de son incorporation. Un autre moyen a été l'utilisation de la spectrométrie de masse, en collaboration avec Luca Signor (plateforme IBS). La spectrométrie de couche ultramince (ultra thin layer spectrometry) a été la méthode employée136_.

Résumé des techniques utilisées en collaborations

Technique Facilités

Spectrometrie de masse Plateforme IBS, Luca Signor

Microscopie électronique Plateforme IBS, Daphna Fenel, Wai-Li Ling

Cryo-Microscopie électronique Wai-Li Ling, équipe Guy Schoehn, IBS Spectrometrie de masse native Elisabetta Boeri Erba, IBS

Résonance Plasmonique de surface Accès à la platerforme IBS, Nicole Thielens

66 Cristallogénèse à diffusion de vapeur Plateforme HTX-Lab, EMBL

Cristallogénèse à phase cubique Vitaly Polivenkin, équipe Valentin Gordely, IBS

Microscopie à force atomique Pierre-Emmanuelle Millhet, CBS, montpellier

Tableau II-2 : Listes de techniques utilisées en collaboration ou avec des plateformes

Tampon Composition

PBS 137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1,76mM KH2PO4

Tampon SEC 20mM Hepes pH 7,4, 100mM NaCl Purification de protéines d’assemblages

Tampon de lyse 20 mM NaPi, pH 7,4, CLAPA 1X, 1 % (w/v) Triton X-100, lysozyme 0,2 mg/mL, DNaseI 0,2 mg/mL

Tampon A 40 mM TrisHCl, pH 8, 300 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100

Tampon B 40 mM TrisHCl, pH 8, 300 mM NaCl, 50 mM NaCholate, 20mM imidazole

Tampon C 40 mM TrisHCl, pH 8, 300 mM NaCl, 50mM imidazole Tampon D 40 mM TrisHCl, pH 8, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole Tampon A’ 20 mM TrisHCl, pH 8, 150 mM NaCl

Tampon B’

Tampon TEV 50 mM TrisHCl, pH 8, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT Tampon

d’assemblage 20 mM TrisHCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA Purification de la protéine YedZ

Tampon A1 TrisHCl 50mM pH8

Tampon 1 50mM TrisHCl pH8, 150mM NaCl, 15mM imidazole, 4mM Cymal 5 Tampon 2 50mM TrisHCl pH8, 300mM NaCl, 15mM imidazole, 4mM Cymal 5 Tampon 3 50mM TrisHCl pH8, 150mM NaCl, 40mM imidazole, 4mM Cymal 5 Tampon 4 50mM TrisHCl pH 8, 150mM NaCl, 300mM imidazole, 4mM Cymal 5 Tampon GF 50mM TrisHCl pH 8, 150mM NaCl, 4mM Cymal 5

67 Purification de la protéine BmrA

Tampon RC 50 mM TrisHCl pH 8

Tampon RM 20 mM TrisHCl pH 8, 300 mM sucrose

Tampon S 50 mM TrisHCl pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM imidazole, Clapa 1X, 1% (w/v) DDM

Tampon Eq 50 mM TrisHCl pH8, 100 mM NaCl, 10 mM imidazole, DDM 0,04%

Tampon L 50 mM TrisHCl pH8, 100 mM NaCl, 20 mM imidazole, DDM 0,04%, CLAPA 1X

Tampon EL 50 mM TrisHCl pH8, 100 mM NaCl, 100 mM imidazole, DDM 0,03% Tampon F 50 mM TrisHCl pH8, 50 mM NaCl, DDM 0,02%

68

RESULTATS