ETUDES DES PROPRIETES ANTIBACTERIENNES DU FILM MINCE HEMA DANS UN SYSTEME MULTICOUCHE

III - 1. Les propriétés antibactériennes du film mince HEMA en surface d’un système multicouche « simple » 132

III - 2. Les propriétés antibactériennes du film mince HEMA après régénération ... 133 III - 3. Conclusion ... 135

IV. SYNTHESE D’UN SYSTEME MULTICOUCHE PAR POLYMERISATION PLASMA A PRESSION ATMOSPHERIQUE : ETUDE DE

FAISABILITE ... 137

IV - 1. Plan d’expérience ... 137 IV - 2. Perspectives ... 141

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I. Structuration multicouche par polymérisation plasma pour une

stratégie antibactérienne à long terme

Pour répondre au cahier des charges fourni par Veolia Recherche et Innovation, la solution proposée est un système multicouche réalisé par polymérisation plasma au sein duquel les propriétés antibactériennes sont assurées par les propriétés mécaniques des couches hydrogels HEMA. L’originalité de cette stratégie repose sur la capacité du système à s’autorégénérer par effeuillage, pour ainsi prévenir la formation de biofilms sur le long terme (Figure 52).

Pour rappel, le système développé présente deux types de couche qui seront alternés : des couches hydrogels possédant les propriétés antibactériennes et des couches hydrophobes possédant des propriétés barrières à l’eau.

Figure 52 : Représentation schématique du système multicouche

Chacune des couches d’hydrogel est déposée sur une couche hydrophobe, formant ainsi un réservoir capable d’absorber une certaine quantité d’eau. Ces deux couches représentent l’unité de base du système multicouche qui est amenée à être répétée N fois. Les résultats décrits précédemment montrent que les propriétés antibactériennes des couches hydrogel HEMA sont excellents. Elles doivent néanmoins conserver ces propriétés antibactériennes une fois emprisonnées entre deux couches hydrophobes au sein du système multicouche. La maîtrise de l’interface hydrogel/couche barrière prend là toute son importance.

De plus, l’effeuillage du système permet la régénération du matériau grâce à la diffusion de l’eau à travers les couches. Il résulte de l’hydrolyse des liaisons entre la couche barrière et la nouvelle couche d’hydrogel. L’hydrolyse est contrôlée par l’intermédiaire des propriétés de l’interface hydrogel/couche barrière (voir Figure 52 et Figure 53). De manière à ce que l’unité de base ne se désagrège pas, le film

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d’hydrogel doit être fortement adhéré à la couche hydrophobe sous-jacente, en présentant une densité élevée de points d’ancrage ; cela afin de résister aux contraintes provoquées par l’expansion de l’hydrogel, essentiellement dans la direction normale au substrat. Au contraire, l’interface entre deux unités du système multicouche doit être faible et sensible à l’hydrolyse. Ces propriétés antagonistes sont obtenues en jouant sur les paramètres de dépôt des couches plasmas pour obtenir des gradients de réticulation dans chacune des couches. La couche d’hydrogel doit présenter le minimum de réticulation à la surface exposée à l’eau et le maximum de réticulation à l’interface avec la couche hydrophobe sous-jacente. Au contraire, la couche hydrophobe présente son maximum de réticulation à cette interface. L’interface la moins réticulée, entre deux unités de base, est plus ou moins sensible à l’hydrolyse (i.e. hydrolyse des fonctions Si-O-C en Si-O-H) ce qui permettra de contrôler le temps de détachement de l’unité supérieure du système multicouche. In fine, la régénération des propriétés anti-adhésion bactérienne est contrôlée par la cinétique d’effeuillages successifs de chacune des unités. Cette cinétique est contrôlable grâce à l’ajustement des paramètres de dépôt plasma au niveau des interfaces. En outre, cette interface doit également préserver la chimie et les propriétés mécaniques de la couche hydrogel sous-jacente afin de préserver les propriétés antibactériennes.

Figure 53 : Représentation schématique de chacune des interfaces mises en jeu dans le procédé d’effeuillage

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II. Elaboration du système multicouche

II - 1. Synthèse d’une couche imperméable à l’eau à partir du précurseur VTMOS

Le précurseur retenu pour réaliser les couches barrières est le vinyltriméthoxysilane (VTMOS). Cette molécule appartient à la liste positive des matériaux pouvant être au contact des aliments [6]_{. La} polymérisation plasma de ce précurseur est largement décrite dans la littérature [160,261–263]_.

II - 1.a. Etude macroscopique des cinétiques de croissance de films polymères plasma

à partir du VTMOS

En traçant le logarithme népérien de la vitesse de croissance normalisée par le flux (ln(R/F)) en fonction de l’inverse de l’énergie spécifique (W/F)-1_{, il est possible d’identifier différents régimes de croissance.} C’est la liaison C=C, qui possède l’énergie de dissociation la plus faible (3,1-3,2 eV) qui est à l’origine du régime I. L’énergie fournie au système est de 3,0 eV par molécule (Ea = 2,3.10-3 _J.cm-3_{) (Tableau 3).} A partir de 2,5.10-2 _J.cm-3_{, l’énergie d’activation est de Ea = 8,37.10}-2 _J.cm-3 _{(107 eV par molécule). Dans} le second régime (régime II), l’énergie d’activation est suffisante pour dégrader toutes les liaisons mises en jeu dans la molécule VTMOS (C-O, 3,7 eV ; C-H, 4,2 eV ; Si-O, 4,68 eV). La vitesse croit alors linéairement jusqu’à atteindre une énergie de 0,1 J.cm-3_{. Au-delà de cette valeur on atteint un plateau,} c’est le régime III. D’une manière analogue au mécanisme décrit pour la polymérisation plasma de HEMA ou DMAEMA, la cinétique de polymérisation est ralentie, probablement en raison de la présence d’espèces oxygénées [208]_{. Au cours du régime IV, elle est inhibée par la forte contribution des}

phénomènes d’ablation favorisés aux puissances élevées (Figure 54).

Précurseur Régime Ea (J.cm-3_{) G (nm.cm}-3₎

VTMOS

I 2,30.10-3 _1,46

II 8,37.10-2 _4,72

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Figure 54 : Représentation de type Arrhenius des vitesses de croissance des films polymères plasma de VTMOS.

II - 1.b. Caractérisations par spectroscopie infrarouge du dépôt polymère de VTMOS

L’étude de l’empreinte chimique des dépôts par spectroscopie infrarouge permet d’approfondir la compréhension des mécanismes de croissance. Avant polymérisation, le précurseur montre, des bandes infrarouges qui lui sont spécifiques [160,264] _{: i) 970 cm}-1 _{[I], 1010 cm}-1 _{[H] et 1410 cm}-1 _[D] caractéristiques des groupes Si-CH=CH2 ; ii) 770 cm-1 _{[K] et 815 cm}-1 _{[J] dues aux liaisons C=C ; iii) 1080} cm-1 _{[G], 1190 cm}-1 _{[F] et 2840 cm}-1 _{[A] caractéristiques des groupes Si-O-CH3 (Figure 55). Une fois} encore, on observe que l’ouverture de la double liaison est le premier mécanisme de polymérisation à être initié aux faibles puissances. La double liaison est consommée dès le régime I. Par contre, l’ensemble des bandes caractéristiques des fonctions Si-O-CH3 ([A], [G] et [F]) sont conservées au-delà du régime I et jusqu’au régime III. Seule la bande, à 1460 cm-1 _{[C], caractéristique des liaisons C-H, croit} fortement au cours de ces trois régimes. Cela reflète une augmentation du taux de réticulation du film polymère. Cela montre qu’une fraction de plus en plus importante des précurseurs est fragmentée et se recombinent dans le polymère plasma en modifiant la proportion des différents groupements. Dans le régime IV, on observe l’apparition de nouvelles bandes : entre 3200 et 3400 cm-1 _{qui indique la} formation de fonctions -OH ; à 1700 cm-1 _{[B] l’apparition de fonction C=O et deux bandes à 1380 cm}-1 [E] et 1460 cm-1 _{[C] attribuées à des groupements méthyles.}

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Figure 55 : Spectres infrarouge de polymères plasmas de VTMOS

Si l’on représente l’intensité des bandes normalisée par le pic à 2950 cm-1 _{(caractérisant les liaisons C-} H) en fonction des différents régimes de croissance, on retrouve la disparition de la double liaison C=C dès le premier régime de polymérisation (Figure 56). La bande à 1080 cm-1_{, quant à elle, diminue au} cours des régimes successifs, ce qui montre une dégradation graduelle des fonctions Si-O-CH3 du précurseur. On retrouve également des produits issus de réactions d’oxydation à travers l’augmentation de la bande à 1460 cm-1 _{qui croit au cours des différents régimes ainsi qu’avec} l’apparition d’une bande à 1700 cm-1 _{au sein du régime IV. Tous ces résultats indiquent que le} précurseur est progressivement dégradé en fonction de l’énergie fournie. Lorsque l’énergie dépasse 0,16 J.cm-3 _{(régime IV), elle est suffisante pour dégrader la totalité de la molécule.}

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Figure 56: Intensités relatives des bandes infrarouges en fonction du régime de croissance lors de la polymérisation plasma.

II - 1.c. Caractérisations de la mouillabilité de la surface et de sa perméabilité à l’eau

Des mesures d’angle de contact ont été utilisées afin de caractériser les propriétés de mouillabilité de la surface du dépôt plasma VTMOS et d’évaluer les propriétés barrières à la diffusion vis-à-vis de l’eau. Les propriétés de mouillage ont été observées dans les mêmes conditions que celles décrites dans la partie Chapitre II : II - 4. Quel que soit le régime de polymérisation utilisé, la goutte atteint quasi- instantanément un état d’équilibre thermodynamique à la surface du film mince. Un angle de contact fini peut être mesuré. Aucun étalement, ni perte de volume n’est observé au cours du temps. La goutte

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est en équilibre thermodynamique. Les valeurs des angles de contact sont comprises, entre 59 et 65°, les écarts-types associés sont faibles ce qui confirme l’homogénéité de la chimie de surface des dépôts.

Figure 57: Evolution des angles de contact en fonction du régime.

L’état d’équilibre thermodynamique de la goutte et l’absence de cinétique dans les valeurs d’angle de contact tendent à montrer que l’eau ne diffuse pas au travers l’épaisseur de la couche plasma de VTMOS. Afin de confirmer ces propriétés barrières, le dépôt plasma de VTMOS a été réalisé sur une couche d’hydrogel HEMA élaborée à une énergie de 0,028 J.cm-3 _{(voir chapitre II - 2.a). A cette énergie,} l’absorption d’une goutte d’eau dans la couche d’hydrogel est très rapide (t < 5 s). Ainsi, si le film mince VTMOS déposé au-dessus de la couche d’hydrogel possède des propriétés barrières, la goutte devra rester en équilibre thermodynamique. Dans le cas contraire la goutte s’absorbera dans la couche hydrogel à travers le couche barrière. L’angle de contact et la hauteur de la goutte évolueront au cours du temps.

Dans un premier temps, les dépôts de VTMOS sont réalisés à une énergie de 0,156 J.cm-3 _{(régime III). Ce régime de croissance a été choisi car il permet d’atteindre des vitesses} élevées. La Figure 58 montre l’évolution des paramètres de mouillage (hauteur de la goutte, angle de contact) en fonction du temps de dépôt. Aux temps inférieurs à une minute, les caractéristiques de la goutte sont identiques à celles observées sur un film mince hydrogel HEMA seul (Figure 58). Le film mince de VTMOS n’impacte pas la diffusion de l’eau dans le film hydrogel. Pour des temps de dépôts compris entre 1 minute et 3 minutes, on est en présence d’un comportement intermédiaire où les caractéristiques de la goutte évoluent. Les écart types élevés sont la signature d’une surface très

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hétérogène. Au-delà de 4 minutes, les caractéristiques de la goutte ne varient pas au cours du temps, l’état d’équilibre thermodynamique est atteint, ce qui reflète de très bonnes propriétés barrières à la diffusion de l’eau. Un temps de dépôt de 4 minutes à une énergie de 0,156 J.cm-3 _{conduit à la formation} d’un film mince de 140 nm (déposé sur wafer de silicium).

Figure 58: Evolution de la hauteur de goutte au temps caractéristique suivant différent temps de dépôt de la couche barrière à une puissance de 0,156 J.cm-3_{. HEMA correspond à la hauteur de la}

goutte au temps caractéristique (Tc = 1,5 s) sans aucun dépôt de couche barrière.

Par la suite, nous avons voulu voir s’il était possible d’atteindre les mêmes propriétés barrières avec des temps de dépôts plus courts, notamment en augmentant l’énergie mise en jeu. La puissance fournie au système a été fixée à 0,625 J.cm-3 _{(régime IV). A ce niveau d’énergie, le taux de réticulation} du film VTMOS est plus élevé. Les résultats montrent que dès 30 secondes de dépôt, on obtient une goutte en équilibre thermodynamique (Figure 59). Le film mince déposé n’est alors que de 18 nm d’épaisseur. Les écart types montrent que le film est homogène sur toute la surface des échantillons, alors qu’il faut atteindre 140 nm d’épaisseur avec une énergie inférieure pour atteindre le même

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résultat. Cette différence est causée par la modification de l’intensité de différents phénomènes dans la phase plasma. Comme l’énergie fournie est plus importante, la quantité d’espèces réactives est accrue et l’impact du bombardement ionique est accentué. Le bombardement ionique accrue génère un plus grand nombre de sites actifs sur la surface, sur lesquels les espèces actives réagissent. Cet accroissement modifie la phénoménologie de propagation des molécules du dépôt. La propagation est plus courte et plus ramifiée formant ainsi un réseau polymère plus dense, induisant par conséquent une sur-réticulation de la surface. Les propriétés de mouillabilité de la surface de l’hydrogel sont alors modifiées en rendant cette surface moins perméable à l’eau [265]_{. Par ailleurs, cette densité ne permet} plus la formation de sites actifs à l’intérieur du film polymère. La croissance du film mince de VTMOS a donc lieu essentiellement à la surface du réseau. Le film mince VTMOS recouvre alors plus rapidement et de manière plus homogène le film hydrogel. Ces modifications permettent d’obtenir une surface où la goutte d’eau est quasi-instantanément en équilibre thermodynamique. L’eau ne diffuse plus à travers les films minces VTMOS avec des épaisseurs inférieures.

Cette seconde stratégie de dépôt montre que l’on peut atteindre des propriétés barrières à l’eau avec des temps de traitement court. Mais dans ce cas, les propriétés de la couche hydrogel sous-jacente peuvent être altérées et modifiées les propriétés antibactériennes. On pense notamment aux effets de surréticulation induits par le bombardement ionique et conduisant à la modification des propriétés mécaniques de la surface.

Finalement, ce sont les dépôts réalisés sous conditions douces (0,156 J.cm-3_{) qui ont été retenue pour} la suite de ce travail.

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Figure 59 : Evolution de la hauteur de goutte au temps caractéristique suivant différent temps de dépôt de la couche barrière à une puissance de 0,625 J.cm-3_{. HEMA correspond à la hauteur de la}

goutte au temps caractéristique sans aucun dépôt de couche barrière.

II - 2. Synthèse du système multicouche

Deux systèmes multicouches différents ont été réalisés. Dans un premier temps, un système multicouche dit « simple » a été synthétisé. Il est composé d’une couche hydrogel déposée sur le substrat3_{, d’une couche barrière et d’une nouvelle couche d’hydrogel. Le second système étudié est}

3 _{La synthèse du système multicouche a été développée sur un wafer de silicium recouvert d’un}

primaire d’adhésion développé par la société AcXys et déposé par polymérisation plasma de l’hexamethyldisiloxane. Ce primaire d’adhésion a deux rôles : le premier est d’assurer la protection du substrat substrat contre la corrosion, le second est d’améliorer l’adhésion de la première couche hydrogel sur le substrat.

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constitué de l’empilement de cinq fois le couple couche barrière – couche hydrogel (Figure 60) sur une couche hydrogel.

Les dépôts des couches hydrogels sont réalisés à une puissance de 5 W avec un cycle de marche de 50 % (0,275 J.cm-3_{, voir Chapitre III : II - 2.a) pendant 46 min afin d’obtenir une épaisseur de 400 nm.} Le dépôt de la couche barrière est réalisé sous une puissance continue de 5 W pendant 5 minutes (0,156 J.cm-3_{, voir Chapitre V : II - 1.a).}

Figure 60: Schéma des deux structures multicouches étudiées.

II - 2.a. Synthèse et observation d’une structure multicouche « simple »

L’épaisseur finale déposée a été mesurée par AFM à la fin de chacune des étapes de dépôts. Les résultats obtenus montrent une bonne corrélation entre les épaisseurs théoriques attendues et les épaisseurs réelles (Table 6).

125 Etapes Epaisseur totale

théorique (nm) Epaisseur totale (nm) Ra (nm) Etape 0 : Primaire d'adhésion 150 171 ± 12 6,6 Etape 1 : Primaire d'adhésion + Hydrogel 550 522 ± 6 8,1 Etape 2 : Primaire d'adhésion + Hydrogel + couche barrière 725 704 ± 22 7 Etape 3 : Primaire d'adhésion + Hydrogel + couche barrière + Hydrogel 1125 1106 ± 18 4,9

Table 6 : Epaisseurs théoriques et expérimentales au cours de la synthèse du système multicouche « simple » et de la rugosité de surface à chacune des étapes. En orange, la couche supplémentaire

ajoutée à chaque étape.

Cette multicouche « simple » a également été observée en immersion par microscopie confocale en réflexion et en fluorescence à 555 nm en marquant avec du tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate (5-TRITC, Sigma Aldrich) les couches hydrogels [266]_{. Afin de visualiser l’alternance des couches, le} système est immergé pendant 15 min dans une solution de PBS avec 10 µL de 5-TRITC. La particularité du 5-TRITC est de marquer uniquement les films hydrogels [266]_{. Lorsque les surfaces sont observées en} immersion par microscopie confocale en fluorescence à 555 nm, le marquage est homogène sur la couche supérieure d’hydrogel (Figure 61 - a). Aucun signal n’est par contre obtenu sur la couche barrière (Figure 61 - b).

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Figure 61: Images en fluorescence de microscopie confocale après marquage au 5-TRITC :a) de la couche hydrogel ; b) de la couche barrière.

Afin d’observer l’empilement des deux couches en coupe, le système est sectionné dans de l’azote liquide puis marqué avec du 5-TRITC. L’observation de la tranche du substrat permet d’identifier les deux films minces d’hydrogel marqués séparés par une couche plus sombre, la couche barrière (Figure 62).

Figure 62 : Images de la tranche de la multicouche « simple » avec les couches hydrogels marqués avec le 5-TRITC.

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L’épaisseur totale du système est d’environ 1 µm et les épaisseurs des deux couches hydrogels sont de l’ordre de 400 nm.

II - 2.b. Synthèse et observation d’une structure multicouche

Un système plus épais a été réalisé par l’empilement de cinq couples, couche hydrogel sur une couche barrière(cf. Figure 60). L’empilement des couches a été controlé par AFM (mesures d’épaisseur) et par imagerie à fluorescence confocale. Les résultats montrent encore une fois une bonne adéquation entre la théorie et l’expérience. L’épaisseur totale mesurée est de 3,98 ± 0,58 µm alors que l’épaisseur théorique est de 3,6 µm.

L’observation de la coupe par microscopie fluorescente confocale après marquage au 5-TRITC confirme les résultats obtenus par AFM (Figure 63). L’épaisseur de l’ensemble de la multicouche est d’environ de 4 µm et le marquage permet d’identifier l’alternance de cinq couches différentes.

Figure 63 : Image de la tranche d'une structure multicouche marqué avec du 5-TRITC. Chaque ligne jaune, espacés de 600 nm, marque la présence d’une couche d’hydrogel.

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II - 3. Stabilité du système multicouche et cinétique d’effeuillage

Pour vérifier la stabilité de l’interface, couche hydrogel – couche barrière, le système « simple » est immergé dans de l’eau du réseau de Mulhouse pendant 48h puis pendant un temps plus long de 3 mois. L’épaisseur totale du système est de 1100 nm ± 100 nm après 48h d’immersion. L’épaisseur du système multicouche est identique à l’épaisseur initiale. Après trois mois d’immersion, la même épaisseur est obtenue. Ces résultats montrent donc que l’assemblage du système multicouche est stable en milieu aqueux pendant un temps de trois mois dans une eau de réseau sans flux.

Ces observations montrent que l’interface hydrogel (déposée à une puissance de 0,275 J.cm-3_{)- couche} barrière reste cohésive dans l’eau. Pour rappel, le principe de l’effeuillage des couches est basé sur l’hydrolyse de l’interface (Chapitre V : I). Cette hydrolyse est longue (de l’ordre de plusieurs mois). Afin de réduire le temps d’effeuillage (i.e. de délamination), le système a été réalisé avec une couche hydrogel synthétisée à une énergie deux fois plus faible (0,138 J.cm-3_{). A ce niveau energétique,} l’hydrogel est très peu cohésif et le nombre de points d’ancrage entre les deux couches est plus faible. L’hydrolyse est donc plus rapide et l’effeuillage intervient (ces résultats seront confirmés par l’analyses antibactériennes Chapitre V : III - 2).

Figure 64 : Images de la couche hydrogel au cours de la délamination de la couche barrière. a) image en réflexion de la surface ; b) image en fluorescence de la surface ; c) reconstruction en 3 dimensions

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La Figure 64 montre les images obtenues par microscopie à fluorescence confocale après effeuillage de la couche barrière. Seul le film hydrogel est visible (marqué en rouge), le film barrière est situé au- dessus de ce dernier. Sur la moitié supérieure des images Figure 64 – a/b, la couche barrière est délaminée. Cette délamination est particulièrement visible sur la Figure 64 – c, où on peut observer l’étirement du film hydrogel au niveau du point de rupture et la présence de résidus d’hydrogel qui sont restés adhérés à la couche barrière. On observe également, en réflexion, la formation de zones de gonflement de l’hydrogel qui créent des structures en forme de bulles. Ces bulles sont des zones gonflées de l’hydrogel. On observe en fluorescence seulement leur pourtour au niveau de la surface de l’hydrogel. Sur la partie basse de l’image Figure 64 – a/b, la couche hydrogel et la couche barrière sont toujours en contact, l’une sur l’autre. Une structure formant un réseau est plus marquée en fluorescence (Figure 64 – b), il s’agit du réseau de diffusion de l’eau à l’interface entre les deux couches.

Figure 65 : Schéma des différentes interfaces et de délamination de la couche barrière.

L’interpénétration des deux réseaux polymères de HEMA et VTMOS permettent d’assurer la cohésion des couches. C’est également le site d’hydrolyse et d’effeuillage. La co-localisation de ces deux phénomènes ne permet pas de régénérer une surface hydrogel sans résidus de la couche barrière après délamination (Figure 65). Cette contamination est problématique car les bactéries sont très sensibles au changement de la chimie sur une surface. Par ailleurs cette contamination accroît