CARACTERISATIONS DES PROPRIETES ANTIBACTERIENNES DES DEPOTS POLYMERES PLASMAS

III - 1. Caractérisation des propriétés antibactériennes des dépôts polymères plasmas vis-à-vis d’une bactérie modèle non soumis à un flux ... 55 III - 2. Caractérisation des propriétés antibactériennes des dépôts polymères plasmas soumis à un flux vis-à-vis d’une bactérie modèle ... 58

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I. La polymérisation plasma

I - 1. La polymérisation plasma à basse pression

I - 1.a. Le réacteur plasma

Le réacteur utilisé au cours de ce projet (Figure 14) est un réacteur cylindrique en verre (6 cm de diamètre, d’un volume de 680 cm3_{) permettant d’atteindre une pression de 5x10}-4 _{mbar avec un taux} de fuite inférieur à 1,0x10-10 _kg.s-1_{. La chambre en verre est entourée par une cage de Faraday. Le} système est composé d’électrodes externes sous la forme d’une spirale de cuivre, constituée d’un fil de 4 mm de diamètre et réalisant 5 spires autour de la chambre du réacteur. Les décharges électriques sont générées par un générateur de radiofréquences (13,56MHz, Dressler, Cesar 133) et l’impédance est équilibrée par une boîte d’accord (Dressler, VM 1500 X-ICP) [146]_{. Les impulsions électriques sont} mesurées à l’aide d’un oscilloscope.

Figure 14 : Schéma du réacteur à basse pression

Lors d’un fonctionnement en mode pulsé, il est possible de calculer la puissance réelle fournie grâce à

l’expression : 𝑾 = 𝑾𝑮[ 𝒕𝒐𝒏

(𝒕𝒐𝒏+ 𝒕𝒐𝒇𝒇)] où WG est la puissance fournie par le générateur et [ 𝑡𝑜𝑛 (𝑡𝑜𝑛+ 𝑡𝑜𝑓𝑓)]

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correspond au cycle de marche du réacteur. ton est la durée d’une impulsion électrique et ton+toff correspond à la durée totale d’un cycle.

Pour la synthèse des systèmes multicouches, ce dispositif est adapté. Un dispositif possédant deux tubes de précurseurs est connecté à la chambre du réacteur. Ce double tube permet de ne pas rompre le vide entre les différentes polymérisations plasmas des précurseurs utilisés pour le système multicouche. On évite ainsi la contamination des différentes interfaces.

I - 1.b. La synthèse des dépôts plasma à basse pression

La chambre du réacteur est dans un premier temps nettoyé avec un détergent puis rincé avec du propan-2-ol. Un plasma air basse pression est ensuite réalisé pendant 30 min à 60W de façon à éliminer tout dépôt résiduel. Les substrats sont ensuite introduits dans le réacteur et placés à 7,5cm par rapport à l’entrée du précurseur. Cette position est conservée au cours des différents dépôts afin de garantir une bonne homogénéité des couches déposées. Le vide est généré à l’intérieur de l’enceinte jusqu’à atteindre une pression de 5.10-3 _{mbar. La vapeur de précurseur est alors introduite dans le réacteur à} un certain débit et une pression donnée (Tableau 1).

Tableau 1 : Tableau des différents précurseurs utilisés ainsi que la pression générée dans le réacteur.

Précurseurs Pression (mbar) Flux (mol.s-1₎

DMAEMA 0,15 3,18.10-7_{± 3,1.10}−8 0,2 4,24.10-7 _{± 3,4.10}−8 0,3 8,06.10-7 _{± 4,4.10}−8 HEMA 0,1 1,13.10-7 _{± 9.10}−9 VTMOS 0,2 3,99.10-7 _{± 3.10}−8

Le plasma est alors initié à une puissance et un cycle de marche donné et pendant un temps déterminé. A la fin du traitement, la décharge électrique est arrêtée mais le flux de précurseur est maintenu durant deux minutes. Cela permet aux derniers radicaux, pouvant subsister à la surface du polymère plasma, de se recombiner. Le réacteur est ensuite ramené à la pression initiale (5.10-3 _{mbar) avant le retrait de} l’échantillon. Un dépôt polymère plasma est ainsi obtenu à la surface des substrats.

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I - 2. La polymérisation plasma à pression atmosphérique

I - 2.a. Le réacteur à pression atmosphérique

Le réacteur utilisé pour développer la polymérisation à pression atmosphérique est basée sur une source plasma DBD (dielectric-barrier-discharge) de la société AcXys (Saint Martin le Vinoux, France) qui fournit une phase plasma sous la forme d’un rideau. Les électrodes de la source sont cylindriques positionnées sur un même axe. La constante diélectrique relative du revêtement dielectrique de l’électrode interne est de εr = 9. Le gaz porteur utilisé est de l’azote, il passe par un volume de 3,7 mL entre les électrodes. Cette source a été intégrée au sein d’une enceinte comportant un dispositif permettant de contrôler le passage de l’échantillon sous le rideau ainsi que sa hauteur par rapport à la source plasma (Figure 15).

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En plus de la position de l’échantillon sous la phase plasma, deux autres paramètres peuvent être contrôlés : la puissance fournie à la phase plasma (de 200W à 500W) ainsi que le débit d’azote transitant au niveau des électrodes (à partir de 25L.min-1_{) (Figure 16).}

Figure 16 : Photos de l’enceinte du réacteur à pression atmosphérique.

I - 2.b. Intégration de la solution d’injection du précurseur

Pour l’injection du précurseur dans le rideau plasma, la technologie retenue repose sur une buse à ultrasons de la société Sinaptec (Figure 17). Le choix s’est porté sur leur matériel en raison de son faible encombrement (48 x 35mm). Cette buse fonctionne à une fréquence autour de 50kHz permettant d’obtenir une granulométrie des gouttelettes de 30 – 35 µm de diamètre pour l’eau pour un débit maximal de 30 mL.min-1_{. La buse est contrôlée par un générateur Inside 150 de la gamme NexTgen} piloté par le logiciel NexTgen version START-TI 1.0.2.0.

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Il a été choisi dans un premier temps de ne pas modifier la première version de l’enceinte du réacteur pour réaliser les premiers essais de polymérisation. Ce choix implique une distance minimum entre la sortie de la source plasma et la buse de 1,5 cm (Figure 18).

Figure 18: Position de la buse à ultrasons.

Le positionnement a été choisi de manière à centrer le cône de diffusion sur le milieu du rideau plasma pour chacune des deux positions étudiées : proche, la buse effleure le rideau plasma ; éloignée, la buse est placée à 1,5 cm du rideau de manière à être dans le cône de diffusion. Le cône de diffusion a une distance de nébulisation d’environ 2 cm quel que soit de la puissance d’assertivement. Par contre l’angle du cône de diffusion n’est pas constant en fonction de la puissance (Tableau 2). Par conséquent, outre la possibilité de diffuser plus largement le précurseur, il est possible, pour un même flux de précurseur, de moduler la quantité de matière atteignant un même point du rideau plasma.

Tableau 2 : Evolution de l'angle de diffusion en fonction de la puissance d'asservissement

Puissance d'asservissement (%) Angle du cone (°)

20 30

80 70

I - 2.c.

Sélection du système de flux du précurseur

Pour amener le précuseur jusqu’à la buse, un système founissant un flux continu a été recherché. Parmi les technologies disponibles, les pompes à pression ont été retenues. Elles permettent d’accéder à des débits faibles et sont couramment utilisés en microfluidique. Un pousse seringue « IVAC PCAM Syringe Pump » (CareFusion) a été utilisé. Il permet l’utilisation de seringues d’un volume de 50 mL et de délivrer un flux de 0 à 35 mL.h-1_.

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I - 3. Les précurseurs sélectionnés

Pour synthétiser les couches hydrogels qui posséderont les propriétés antibactériennes, deux précurseurs appartenant à la liste positive des matériaux pouvant être au contact des aliments ont été sélectionnés.

I - 3.a. Le méthacrylate de 2-(diméthylamino) éthyle (DMAEMA)

Le DMAEMA (Figure 19) est un polymère qui est couramment utilisé lors de copolymérisation [147]_{. Il a} fait l’objet d’une étude récente quant à son utilisation au sein de procédé de polymérisation par voie plasma qui démontre la faisabilité de créer des dépôts polymères plasmas [148]_{. Par ailleurs plusieurs} études présentent des résultats montrant que le DMAEMA polymérisé possède des propriétés antibactériennes notables notamment à l’encontre des bactéries Gram négatives [149][150]_{. Cet effet} antibactérien semble lié au groupement amine du précurseur qui peut être protonné et ainsi pouvoir potentiellement désorganiser la membrane bactérienne.

Figure 19 : Formule du 2-(diméthylamino) éthyle méthacrylate

I - 3.b. Le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle (HEMA)

Le HEMA (Figure 20) est un précurseur couramment utilisé pour de nombreuses applications nécessitant des hydrogels ou en copolymérisation [151–153]_{. Parmi les utilisations, on retrouve des} applications pour des applications antibactériennes et antifouling [153–155]_{. Il présente l’avantage d’avoir} déjà été utilisé en polymérisation plasma à basse pression et à pression atmosphérique [156–159]_{. C.} Tarducci et al. ont montré qu’il est possible d’obtenir un film mince comportant une concentration élevée et bien définie de groupements hydroxyles. Les propriétés chimiques des films minces obtenus ainsi que les cinétiques de croissance en mode pulsé ou en continu sont très bien décrites. Néanmoins aucune information n’est donnée sur leur capacité à absorber et à désorber de l’eau ni sur les propriétés mécaniques associées à ces différents films minces.

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Figure 20 : Formule du 2-hydroxyéthyl méthacrylate

Le vinyltriméthoxysilane (VTMOS)

Pour synthétiser les couches barrières du système multicouche, un précurseur siliconé a également été sélectionné sur la liste positive des matériaux pouvant être au contact des aliments. Il a fait l’objet de plusieurs études de synthèse par polymérisation plasma, que cela soit à base pression ou à pression atmosphérique afin de modifier les propriétés de mouillabilité de différents substrats [160–162] _(Figure 21).

Figure 21: Précurseur de vinyltriméthoxysilane

I - 4. Les substrats utilisés

Les substrats utilisés au cours de cette étude sont des wafers de silicium poli d’une épaisseur de 380 µm (Si-MAT, Allemagne). Ils sont nettoyés à trois reprises par ultrasons (Transonic TI-H-F, Elma) dans une solution de chloroforme pendant 15 min à 45 kHz. Ils constituent la surface de référence (1 x 1 cm2 _{sauf pour les études microbiologies sous flux : 1 x 0,5 cm) pour toutes les expériences de} cette étude.

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II. Caractérisations physico-chimiques des dépôts polymères

plasmas

II - 1. Caractérisation par microscopie à force atomique (AFM)

II - 1.a. Mesure de l’épaisseur des films minces

Un AFM Dimension 3000 avec un contrôleur NanoScope IIIa (Veeco, Allemagne) a été utilisé pour contrôler les épaisseurs des films. Les mesures sont effectuées en mode « sans contact » avec des pointes Si possédant une rigidité de 0,1-0,6 N.m-1 _{(AppNano, USA). La mesure d’épaisseur est réalisée} après avoir créé manuellement un défaut à la surface du film mince à l’aide de la pointe d’une aiguille. Au moins trois zones (20 x 80 µm) sont mesurées afin de confirmer l’homogénéité du dépôt polymère.

II - 1.b. Caractérisations morphologique et mécaniques des films minces

La rugosité et les propriétés mécaniques des films minces en milieu liquide ont été caractérisées en milieu liquide dans du PBS à température ambiante avec un AFM Multimode IV (Bruker, USA) disposant d’un contrôleur NanoScope V et d’un scanner “vertical” E (PF-QNM®, Bruker). Pour cela trois zones par échantillons sont scannées (1 µm x 1 µm) sur chaque échantillon.

Les propriétés mécaniques de surface sont mesurées grâce au module PF-QNM. Les mesures sont réalisées avec des leviers ScanAsyst (Bruker, USA) possédant une constante de raideur de 0,4 N.m-1_, une fréquence de résonance de 70kHz et un rayon de courbure de la pointe de 10nm. Cette méthode nécessite une connaissance très fine de la géométrie des leviers. C’est pourquoi chaque levier est contrôlé avant son utilisation. Le rayon de courbure réel observé est de 18nm, quant à la sensibilité de la déviation et la constante de raideur, elles sont déterminées en utilisant une méthode de calibration absolue « thermal tune » [163] _{qui donne une valeur expérimentale de 0,3 N.m}-1_{. Le PF-QNM fonctionne} en mode « contact » basé sur la méthode force-volume. La force maximale est contrôlée à chaque pixel pour obtenir des courbes force-distance (recueillies à une fréquence de 2 kHz) par nanoindentation qui sont ensuite utilisées comme signal de rétroaction. Cette méthode permet d’obtenir, en parallèle, des images de topographie, des informations sur la déformation et les forces d’adhésion pointe-surface ainsi que sur l’élasticité du matériau (module de Young).

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II - 2. Caractérisation par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

La caractérisation de la chimie des dépôts polymères plasmas est effectuée avec un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier IFS66/S (Bruker) refroidi par azote liquide. Les mesures sont réalisées en transmission sur une pastille de KBr préalablement traitée par polymérisation plasma. Les spectres des précurseurs sont quant à eux réalisés en déposant une goutte sur une pastille de KBr. Les mesures sont alors faites dans les mêmes conditions que pour les dépôts plasmas avec une surface d’analyse de quelques mm². Les spectres obtenus résultent de la superposition de 50 scans à une résolution de 4 cm-1_.

II - 3. Caractérisation par spectrométrie de photoélectrons induits par rayons X (XPS)

La caractérisation de la chimie de l’extrême surface de dépôts polymères plasmas est réalisée par des analyses XPS sur un VG SCIENTA SES-2002 équipé d’une source de rayon X monochromatique Al Kα (1486 eV) à une puissance de 420W (14 kV, 30 mA). L’aire analysée est de d’environ 3 mm² et les photoélectrons sont collectés par le détecteur positionné à 90° de l’échantillon (à 10-9 _{mbar). Deux} types de spectres sont acquis, des spectres de survol acquis avec une énergie de 700 eV et des spectres hautes résolutions des espèces C(1s), O(1s) et N(1s) acquis avec une énergie de 100 eV. La position 285,0 eV des énergies de liaison des groupements CHx est utilisée comme référence. Les spectres obtenus sont décomposés à l’aide du logiciel CASAXPS en utilisant la méthode Gaussien-Lorenzien en utilisant les valeurs des largeurs à mi-hauteur des courbes (fwhm). Les proportions des pourcentages atomiques sont déterminées en intégrant l’aire les pics en prenant en compte le libre parcours moyen et le facteur de Scofield de chaque atome (C(1s), 1,00 ; N(1s), 1,77 ; O(1s), 2,93)

II - 4. Caractérisation par mesure d’angle de contact

Les mesures d’angle de contact sont réalisées à l’aide d’un goniomètre DSA 100 (Krüss). Le volume de la goutte d’eau distillée utilisée est de 5µL. Les cinétiques des angles de contact ainsi que l’évolution de la hauteur, du diamètre et du volume de la goutte sont suivis sur un intervalle de temps de 45s. Pour caractériser leur évolution, les mesures de hauteur Ht, de diamètre Dt et de volume Vt recueillies à chaque temps sont rapportées à celles mesurées au moment où la goutte entre en contact avec la surface (H0, D0 et V0). On compare alors les paramètres à un temps caractéristique pour chaque surface (Annexes Figure 73). Chaque mesure est reproduite à trois reprises sur trois échantillons différents.

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III. Caractérisations des propriétés antibactériennes des dépôts

polymères plasmas

III - 1. Caractérisation des propriétés antibactériennes des dépôts polymères plasmas vis-

à-vis d’une bactérie modèle non soumis à un flux

III - 1.a. Bactérie modèle : Escherichia coli K12 SCC1

La bactérie modèle Escherichia coli (E.coli) K12 SCC1 [164] _{choisie pour étudier les effets antibactériens} des dépôts polymères plasma est une bactérie Escherichia coli (E.coli) MG1655, disposant d’une inclusion GFP (Green Protein Fluorescent) dans son génome. Les bactéries obtenues produisent alors naturellement de la GFP. Ces molécules, lorsqu’elles sont soumises à une excitation laser à 488nm, émettent dans le vert autour de 510nm.

III - 1.b. Culture microbiologique d’Escherichia coli K12 SCC1 sur surface non soumise

à un flux

Les E.coli sont cultivées dans un milieu M63G à pH 6,8 à 30°C. Avant chaque ensemencement sur surface, les bactéries sont placées en culture dans un milieu M63G pour une pré-culture de 14h à 30°C. De cette pré-culture, on prélève 10% de son volume afin d’inoculer une seconde pré-culture de 4h à 30°C avec le même volume final. Pour finir, la seconde pré-culture est centrifugée puis le culot est resuspendu dans un milieu M63G frais. La densité optique (DO) de la culture bactérienne, mesurée à 600nm est alors ajustée à une DO = 0,01 avant l’ensemencement des surfaces, afin d’avoir 5.106 bactéries.mL-1_{. Les cultures bactériennes statiques sont réalisées dans des puits de 35mm de diamètre} sans flux ni renouvellement du milieu. Chaque substrat d’un centimètre carré est fixé au fond d’un puits. Les substrats sont alors ensemencés avec 2,75mL de solution bactérienne (DO = 0,01). Les cultures sont placées à 30°C pendant une durée déterminée. A la fin de ce temps de culture, les substrats sont rincés doucement avec une solution de NaCl (9 g.L-1_{), à trois reprises, sans passage à} l’air des surfaces, permettant ainsi d’éviter tout démouillage des bactéries adhérées.

III - 1.c. Dénombrement des bactéries colonisant les surfaces

Le dénombrement des bactéries sur la surface est réalisé avec un microscope confocal Zeiss LSM 700 qui est monté sur un statif droit et équipé d’un objectif LD EC « Epiplan-Neofluar » 50x/0,55 DIC M27 à longue distance focale (9,1mm). Cet objectif permet l’observation des substrats en les maintenant

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en immersion dans une solution de NaCl 9 g.L-1_{. L’acquisition des images microscopiques est réalisée} de deux manières différentes :

Dans le cas d’un dénombrement simple des bactéries présentes sur la surface, l’acquisition est réalisée en capturant dix champs par échantillon de manière aléatoire.

Dans le cas où il est choisi d’évaluer également la mobilité bactérienne sur la surface, l’acquisition est également réalisée en capturant dix champs par échantillon de manière aléatoire. Cependant, pour chaque champ capturé, deux images sont prises à un intervalle de temps donné de 15 secondes. De cette manière, il est possible de différencier les bactéries adhérées, des bactéries mobiles et d’effectuer ultérieurement leurs dénombrements [165]_.

Dénombrement des bactéries adhérées

Le dénombrement des bactéries à partir des images est réalisé grâce au logiciel ImageJ [166] _par l’intermédiaire duquel plusieurs traitements d’image sont effectués avant d’utiliser l’analyseur de particules du logiciel. Ces traitements sont :

- Une normalisation des couleurs par l’intermédiaire d’un plugin nommé « Retinex ».

- Une division des canaux de couleurs Rouge, Vert et Bleu afin de ne conserver que le canal vert. - Une étape de seuillage en utilisant la méthode Otsu [167] _{ou Intermodes en fonction du type} d’histogramme généré par l’image. La méthode Intermodes est particulièrement indiquée lorsque l’histogramme est bimodal et possède une petite vallée.

Suite à ces traitements, l’image obtenue permet le dénombrement des bactéries présentes en fonction de leur taille. Cela donne la possibilité de dissocier des bactéries collées les unes aux autres en ségrégant les éléments dénombrés en fonction de l’aire totale (Figure 22).

Dénombrement des bactéries mobiles par rapport aux bactéries adhérées

Le dénombrement des bactéries mobiles est réalisé de la même manière et avec les mêmes étapes que précédemment pour chacune des images espacées d’un temps donné. Le processus possède une étape supplémentaire consistant à différencier les bactéries mobiles des bactéries adhérées. Pour cela, la seconde image est soustraite à la première et un nouveau dénombrement est réalisé à partir de l’image résultant de cette soustraction. En appliquant un seuil de détection inférieur, en fonction des critères de mobilité recherchés, il est ainsi possible de dénombrer uniquement les bactéries qui se sont déplacées pendant le temps donné entre les deux images (Figure 23).

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Figure 22 : Principe de dénombrement par ségrégation des tailles d’éléments dénombrés.

Figure 23 : Schéma de la méthode du dénombrement des bactéries mobiles et des bactéries adhérées

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Mesure de la mobilité des bactéries

La mobilité des bactéries est observée par microscopie confocale en prenant 60 images consécutives toutes les 0,97 secondes. Cet écart entre deux images a été choisi en fonction de plusieurs facteurs : la vitesse de déplacement des bactéries, leur nombre, les vitesses de balayage disponibles et la résolution de l’image obtenue. Il en résulte que ces paramètres d’observations permettent d’avoir un suivi optimal d’un grand nombre de bactéries (jusqu’à 200) en raison de la faible distance de déplacement des bactéries entre deux images. Dans un même temps, on conserve des paramètres d’acquisition de microscopie permettant de bénéficier d’une bonne résolution de l’image tout en préservant l’intensité de la fluorescence de la GFP.

On détermine ensuite les vitesses de déplacement des bactéries en utilisant TrackMate, le module d’ImageJ® qui permet de faire des suivis de particules dans un plan pouvant entrer en contact. Un traitement d’image identique a été réalisé avant d’effectuer le suivi des particules avec une méthode nommée LAP Tracker [168] _{et disponible dans le plugin TrackMate. Les résultats obtenus permettent de} déterminer la distance parcourue de la particule (ici la bactérie), la vitesse de déplacement ainsi que la distance entre le point initial et le point final du trajet.

III - 2. Caractérisation des propriétés antibactériennes des dépôts polymères plasmas

soumis à un flux vis-à-vis d’une bactérie modèle

III - 2.a. Culture microbiologique d’Escherichia coli K12 SCC1 sur surface soumise à un

flux

L’étude de l’adhésion des bactéries sur des matériaux opaques et soumises à un flux est un domaine développé depuis de nombreuses années à l’IS2M à travers de nombreux projets. Ceux-ci ont permis de faire évoluer les différentes approches développées pour s’adapter aux contraintes inhérentes à l’observation de bactéries et de cellules dans des conditions particulières de flux, de température ou de milieu de culture, par exemple. Cette expertise a permis de développer le protocole utilisé lors des expériences mises en place au cours de ces travaux de thèse. La maturation de la méthode développée permet maintenant d’envisager la soumission d’une note dans « Journal of Microbiological Methods » détaillant le système utilisé avec pour auteurs les différents acteurs du laboratoire IS2M ayant participé au développement :

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Mathieu Veuillet, Charline Soraru, Adeline Marguier, Victor Prevost, Lydie Ploux,

Journal of microbiological methods, en cours de soumission