III.1 Co-purification et co-précipitation
III.1.1 Co-purification AMSH Fl/ CHMP3 Fl
Les protéines AMSH Fl et CHMP3 Fl sont purifiées comme décrit dans les paragraphes I.1.1 et I.2.2. Elles sont ensuite mélangées avec un excès de CHMP3 Fl (rapport molaire 1:3) puis concentrées jusqu’à 500 µL afin de purifier le complexe sur une colonne de filtration sur gel S75 (GE Healthcare) pré-équilibrée avec le tampon 20 mM HEPES pH 8, 100 mM NaCl.
III.1.2 Co-précipitation
30 µL de billes de résine glutathion sépharose sont lavés deux fois avec 1 mL de tampon A : 50 mM Tris pH 8,5, 100 mM NaCl, 0,01% Triton puis 10 µg de protéine de fusion avec l’étiquette GST (GST-CHMP1A C-ter ou GST-CHMP1B C-ter) sont incubés pendant 1h à température ambiante et agités par une roue. Les billes sont ensuite lavées deux à trois fois
avec le tampon A puis 100 µL de BSA à 10 mg.ml-1 sont ajoutés et incubés 10 minutes à
température ambiante afin de bloquer les billes. La résine est à nouveau lavée puis 20 µg de la protéine proie (AMSH 146 sauvage ou muté) sont ajoutés et incubés 1h dans les mêmes conditions que précédemment. Quatre à cinq lavages de 10 minutes avec le tampon A sont effectués puis les protéines fixées par la résine sont éluées avec 30 µL de bleu de charge amené à ébullition. Finalement, un gel SDS-PAGE est réalisé afin de visualiser les résultats.
III.2 Résonance plasmonique de surface (SPR)
III.2.1 Principe
La résonance plasmonique de surface est une méthode qui permet de déterminer l'affinité d'interaction entre deux molécules, l'une attachée (ligand) sur une fine surface d’or et l'autre écoulée (analyte) sur cette surface dans un fluide continu. Le phénomène de résonance plasmonique de surface a lieu quand une lumière polarisée est dans des conditions de réflexion totale et qu'elle heurte la surface conductrice (or) à l'interface entre la plaque de
71 verre de la puce et le liquide écoulé. Alors un champ électrique est créé: l'onde évanescente. Celle-ci interagit avec la couche d'or ce qui génère des ondes de charges électriques appelées plasmons. Ces plasmons réduisent l'intensité de la lumière réfléchie mesurée par le système de détection. L'angle auquel l'intensité est la plus faible dépend de l'indice de réfraction de la solution attenante à la couche d'or. Cet indice sera modifié par l’interaction ou non des deux protéines d'intérêt (figure 28).
Figure 28 : Illustration des composants d’un système de mesure des résonnances plasmonique de surface. (Patching, 2013)
Tout au long de l'expérience l'appareil mesure les changements de signal et les retranscrit sous forme de sensogramme. Quand une molécule lie la surface de la puce, le signal augmente et quand cette molécule se détache le signal diminue. Nous pouvons ainsi observer sur le sensogramme des phases d'association et des phases de dissociation. L'analyse des courbes
permettra ensuite d'obtenir des paramètres cinétiques comme la constante d’association (kon
ou ka) ou la constante de dissociation (koff ou kd) et de calculer la constante d’affinité (KD) de
l'interaction étudiée avec :
KD = koff/kon = [ligand][analyte]/[complexe ligand-analyte] (4) avec [X] la concentration des protéines (figure 29).
A la fin de l’expérience l’analyte peut être décroché grâce à différentes solutions de régénération (bas/haut pH, haute concentration en sel, détergent) et la puce contenant le ligand peut être réutilisée. Cette technique a l’avantage de pouvoir mesurer des interactions dans une fourchette très large (nM-mM) en utilisant des échantillons de faible volume et à basse concentration.
72 Figure 29 : Schéma représentant un sensogramme classique des différentes phases visualisées en SPR. (GE Healthcare-Biacore)
III.2.2 Conditions expérimentales
AMSH D348A et STAM2 V.U.S
Les protéines sont purifiées comme décrit dans les sections I.1.1 et I.3.1 puis dialysées dans du tampon J : 10 mM HEPES pH7,6, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA, 0,005% surfactant P20. La fixation du ligand sur la puce est covalente grâce à un couplage amine. A l’aide d’un
système Biacore® 3000, la surface des deux premières cellules (« Flow cell » : Fc1 et Fc2)
d’une puce CM5 (GE Healthcare) est activée par l’injection de 50 µL d’un mélange
équimolaire d’EDC et NHS à un flux de 10 µL.min-1
. Le ligand, ici AMSH D348A, est dilué 200 fois (concentration finale = 50 nM) dans du tampon 10 mM d’acétate de sodium pH 4,5 et
est attaché de façon covalente sur Fc2. Les deux surfaces sont ensuite inactivées par injection
de 50 µL d’éthanolamine 1 M à un flux de 10 µL.min-1
. Au final, le signal de fixation d’AMSH sur la puce correspond à environ 2700 RU (unité de réponse arbitraire). La suite de l’expérience est réalisée dans du tampon J. Après injection de l’analyte (STAM2 V.U.S.) à 4500 nM, différentes solutions de régénération sont testées et la solution retenue est le tampon J contenant 0,015% de SDS. Les concentrations d’analyte varient de 750 à 9000 nM et le flux
est fixé à 10 µL.min-1, le temps d’injection est de 5 minutes et le temps de dissociation de 15
minutes. Les mesures sont réalisées de façon aléatoire par rapport à la concentration de l’analyte. Un contrôle négatif est enregistré en écoulant seulement du tampon J et deux concentrations sont réalisées en duplicat.
73 AMSH Fl et STAM2 UIM-SH3
Les protéines sont purifiées comme décrit dans les sections I.1.1 et I.3.2 puis dialysées dans du tampon J. La même procédure que précédemment est utilisée pour fixer le ligand, AMSH Fl, qui est diluée 100 fois (concentration finale = 720 nM) dans du tampon 10 mM d’acétate de sodium pH 4,5. Au final, le signal de fixation d’AMSH Fl sur la puce correspond à environ 9300 RU. La suite de l’expérience est réalisée dans du tampon J. A la fin de l’injection de l’analyte (STAM2 UIM-SH3) à 7500 nM, le signal revient au niveau de base, il n’y a donc pas besoin de solution de régénération. Une série de mesures est ensuite réalisée pour des
concentrations d’analyte variant de 750 à 7500 nM, le flux est fixé à 10 µL.min-1
, le temps d’injection est de 5 minutes et le temps de dissociation de 10 minutes. Les mesures sont réalisées de façon aléatoire par rapport à la concentration de l’analyte. Un contrôle négatif est enregistré en écoulant seulement du tampon J et deux concentrations sont réalisées en duplicat.
III.2.3 Traitement et analyse des données
Les données sont traitées avec le logiciel BIAevaluation 3.0 (Biacore®). L’analyse s’effectue sur les courbes pour lesquelles le bruit enregistré grâce à Fc1 est soustrait, c’est-à-dire celles
reportées sur le sensogramme Fc2-Fc1. Les courbes sont tout d’abord alignées selon les axes x
et y puis tout ce qui ne correspond pas à la phase d’association ou de dissociation est supprimé. La courbe correspondant au contrôle négatif est soustraite à toutes les autres courbes afin d’annuler l’effet du tampon sur l’enregistrement. La fonction « fit global » est ensuite utilisée pour superposer au mieux le modèle cinétique théorique langmuir 1 :1 aux
données expérimentales et calculer les paramètres cinétiques (kon, koff et le KD).
La bonne superposition du modèle aux courbes expérimentales est contrôlée de trois façons : visuellement, en s’assurant qu’il n’y ait pas d’aberrations pour certaines parties des courbes,
statistiquement, en obtenant une valeur du test Chi2 inférieure 5% du Rmax (capacité de
liaison maximum du ligand) et en observant les écarts résiduels qui doivent idéalement être compris entre -2 et 2.