Etude de l’interaction entre AMSH et CHMP1A ou CHMP1B

L’interaction d’AMSH avec les protéines CHMP1A et CHMP1B a été identifiée par Agromayor et Martin-Serrano en 2006. Ces dernières forment aussi un complexe avec d’autres protéines contenant un domaine MIT comme VPS4, UBPY ou la spastine (Stuchell-Brereton et al., 2007) (Row et al., 2007) (Yang et al., 2008). Afin de déterminer si AMSH interagit avec les protéines CHMP1 de la même façon qu’avec CHMP3 nous avons réalisé des mesures d’interaction par SPR et des essais de co-précipitation

I.1.3.1 Purifications

MBP-AMSH 206 :

Les expériences de SPR entre AMSH et CHMP1A ou 1B nécessitaient la purification de plus de matériel biologique que pour les tests de co-précipitation, or AMSH N-ter 146 était trop peu soluble. Nous avons donc choisi de travailler avec une construction plus longue d’AMSH N-ter : AMSH 206, comportant une étiquette MBP à son extrémité N-terminale. Le protocole de purification de MBP-AMSH 206 a été modifié plusieurs fois afin d’être amélioré. Initialement, il était composé d’une colonne d’amylose suivie d’une colonne échangeuse d’anion (HiTrap Q) puis d’une filtration sur gel sur colonne S200. Le premier milieu de culture utilisé était du milieu LB miller mais nous nous sommes aperçu que notre protéine était mieux exprimée et plus soluble lorsque la culture était réalisée dans un milieu plus riche, le TB (terrific broth). Aussi, le tampon de lyse initial, ainsi que tous les autres tampons de purification contenaient de l’HEPES pH 8,0 idéal pour mesurer les résonnances plasmoniques de surface (SPR). Dans un premier temps, comme pour AMSH 146, nous avons essayé d’améliorer la solubilité de la protéine en ajoutant de l’arginine et du glutamate dans ces tampons mais ces additifs n’ont pas apporté d’évolution. Ensuite, AMSH 146 étant plus soluble dans du tampon Tris, nous avons effectué les deux premières étapes de purification de MBP-AMSH 206 dans ce tampon ce qui nous a permis d’augmenter la solubilité de notre protéine. Alors, MBP-AMSH 206 élue de la colonne échangeuse d’anion dès 230mM de NaCl puis les agrégats toujours présents dans l’échantillon sont séparés lors de la dernière étape de filtration sur gel. Celle-ci permet aussi d’obtenir MBP-AMSH 206 dans du tampon 50 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl et 3,4 mM EDTA (tampon de SPR). Elle peut être répétée plusieurs fois et la protéine ainsi purifiée sera concentrée jusqu’à 15 µM. (figure 36)

83 Figure 36 : Profils d’élution de MBP-AMSH 206 sur colonnes échangeuse d’anion et de filtration sur gel. A) Elution et gel SDS-PAGE de colonne échangeuse d’anion HiTrap Q. B) Elution et gel SDS-PAGE de filtration sur gel S200.

CHMP1A C-ter, 1B C-ter:

Les protéines CHMP1A C-ter, CHMP1B C-ter ont-elles aussi été purifiées afin de réaliser des tests d’interaction avec AMSH 206. Elles ont été clonées dans le vecteur d’expression bactérienne pGEX4T3 et possèdent donc une étiquette GST (glutathion S-transferase). Cette étiquette est conservée et sera utilisée pour accrocher le ligand CHMP à une puce CM5. La première étape de purification est une colonne de glutathion sépharose suivie directement d’une filtration sur gel S200. Le profil d’élution (figure 37A et B) n’est pas parfaitement symétrique et les protéines éluent à un volume correspondant à une forme dimérique en solution. Cela peut être dû à une dimérisation de l’étiquette GST. Des produits de dégradation sont aussi visibles sur le gel SDS-PAGE (figure 37A et B) mais ils sont très minoritaires par rapport à la protéine d’intérêt.

84 .

Figure 37 : Dernière étape de purification des protéines CHMP1A C-ter et GST-CHMP1B C-ter. A) Profil d’élution d’une colonne S200 et gel SDS-PAGE de GST-CHMP1A C-ter. B) Profil d’élution d’une colonne S200 et gel SDS-PAGE de GST-CHMP1B C-ter. I.1.3.2 Mesure des résonances plasmoniques de surface entre MBP-AMSH Nter206 et GST-CHMP1A C-ter ou GST-CHMP1B C-ter (SPR)

Afin d’étudier s’il existe différentes interactions entre AMSH et les protéines CHMP, nous avons mis en place des mesures de résonances plasmoniques de surface entre CHMP1A ou CHMP1B et AMSH 206(figures 38 et 39). A chaque changement à la surface de la puce, le signal est enregistré et retranscrit sur un sensogramme en RU (response unit ou resonance unit), c’est une unité arbitraire telle que 1 RU correspond à un changement d’angle de 0,0001°. Lors de ces mesures CHMP1A ou 1B sont les ligands, attachés à la puce CM5 via des anticorps anti-GST et AMSH 206 est l’analyte, écoulé sur la surface.

85 Figure 38 : Analyse des résonnances plasmoniques de surface du complexe AMSH N-ter 206/CHMP1A C-ter.

Figure 39 : Analyse des résonnances plasmoniques de surface du complexe AMSH N-ter 206/CHMP1B C-ter.

86 Les figures 38 et 39 montrent les résultats d’interaction mesurée par SPR obtenus pour AMSH 206 avec, respectivement, CHMP1A C-ter et CHMP1B C-ter. Grâce à la superposition du modèle théorique 1 :1 langmuir aux résultats expérimentaux et grâce aux

calculs du logiciel BIAevaluation (Biacore), nous obtenons des constantes d’affinités (KD) de

1,49 µM pour CHMP1A et 1,16µM pour CHMP1B. Ces deux valeurs sont très proches et environ 20 fois plus élevées que celle mesurée pour l’interaction CHMP3 et AMSH 206. Ce qui signifie que CHMP3 a une affinité 20 fois plus forte pour AMSH 206 que CHMP1A ou CHMP1B. Cette préférence d’AMSH pour CHMP3 peut être due à différents modes d’interaction. Alors, la mutation des résidus K88, E104 et K107, que nous avons identifiés précédemment comme étant des résidus clefs dans l’interaction CHMP3/AMSH, ne changerait pas la capacité d’AMSH à co-précipiter CHMP1A ou CHMP1B. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons donc mis en place des essais de co-précipitation de CHMP1B par AMSH sauvage ou muté.

I.1.3.3 Co-précipitation

Ces essais de co-précipitation ont été effectués plusieurs fois afin de déterminer les meilleures conditions d’interaction sans qu’il y ait d’interactions non spécifiques. Après optimisation, le tampon final contient : 50 mM Tris pH 8.5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, 0.25% CHAPS. Le CHAPS est essentiel pour limiter les interactions non spécifiques entre GST-CHMP1B et la résine de nickel.

Figure 40 : Test d’interaction entre AMSH 146 et CHMP1B C-ter. Gauche : quantité de protéine utilisée pour chaque test. Droite : co-précipitation de CHMP1B par His-AMSH 146 sauvage ou muté

Nous pouvons remarquer dans la figure 40 que l’intensité de la bande de co-précipitation de CHMP1B par AMSH 146 sauvage est similaire à celle des bandes de co-précipitation par AMSH muté K88A ou E104A. La mutation de ces résidus n’a donc pas d’effet sur la liaison entre AMSH et CHMP1B. Ce résultat est différent de celui observé pour CHMP3 et confirme que les résidus impliqués dans l’interaction entre AMSH et CHMP3 ne sont pas les mêmes que ceux impliqués dans l’interaction de notre enzyme avec CHMP1B.

87 Les résultats de co-précipitation d’AMSH sauvage ou muté et CHMP3/CHMP1B et de mesure d’interaction par SPR confirment que malgré leur structure similaire en hélice-α CHMP3 C-ter et CHMP1A/1B C-ter doivent interagir avec AMSH de manière différente. Ces données ont permis de compléter celles obtenues auparavant au sein de l’équipe et d’aboutir à la publication d’un article scientifique dans le journal Structure intitulé : «Structural basis for ESCRT-III CHMP3 recruitment of AMSH » (annexe).