Etudes in vivo

4.2.2.1 Etude de la neurovirulence du VACV

Dans un premier temps, une étude de la neurovirulence des deux souches virales de VACV a été réalisée sur un modèle souriceau nouveau-né. Des souriceaux Swiss-OF1 agés de trois jours ont été inoculés par voie intracérébrale avec 50 PFU de VACV-WR, de VACV-List ou de milieu pour le groupe contrôle. La survie a ensuite été observée quotidiennement pendant deux semaines (Figure 30). Alors que les souriceaux du groupe contrôle ont survécu à l’injection, les souriceaux inoculés avec le VACV-WR ou le VACV-List ont développé des signes d’atteinte cérébrale (tremblements et léthargie) dès le 3ème jour p.i., preuve d’une réplication virale dans le tissu cérébral. De plus, 100 % des animaux infectés avec VACV-WR et 95 % de ceux infectés avec VACV-List ont succombé (Test du Log-rank, p<0,0005). Alors que la mort des animaux est apparue entre le 5ème et le 6ème jour p.i. suite à l’infection avec VACV-WR, les animaux inoculés avec le VACV-List ont succombé à l’infection entre le 6ème et le 10ème jour p.i. Le délai observé est la conséquence d’une plus forte virulence de la souche Western-Reserve comparativement à la souche Lister. Néanmoins les deux souches sont neurovirulentes et par conséquent responsables d’atteintes cérébrales conduisant à la mort de l’animal après inoculation intracérébrale.

4.2.2.2 Etude de la pathogénicité du VACV inoculé par voie intraveineuse

Afin d’étudier la pathogénicité et les capacités neuroinvasives du VACV in vivo, après observation du franchissement de la BHE in vitro, un modèle murin a été développé. Des souris C57BL/6 ont été infectées par injection intraveineuse de 108 PFU de VACV-WR. Un groupe de souris pré-traitées par trois injections de LPS a été infecté en parallèle, en vue d’observer l’effet d’une altération préalable de la BHE sur la neuroinvasion du VACV. Plusieurs critères ont ensuite été étudiés sur ce modèle murin.

Dans un premier temps, afin de vérifier l’efficacité du protocole d’injection du LPS sur la perméabilité de la BHE des animaux, des essais de visualisation de l’entrée d’un

traceur, le bleu Evans dans le tissu cérébral ont été réalisés. En effet lorsqu’il est injecté chez l’animal, ce colorant se fixe à l’albumine plasmatique dont l’importante taille (60 kDa) limite son franchissement au travers de la BHE. Après traitement, la coloration bleue du tissu cérébral est donc le témoin d’une perte d’intégrité importante de cette barrière. Des souris ont donc été injectées dix-huit heures après la dernière administration de LPS par voie intrapéritonéale avec une solution de bleu Evans à 1 %. Une très faible coloration du tissu cérébral a été observée mais elle n’était pas suffisante pour conclure à une altération majeure de la BHE (résultats non montrés).

Différents critères de pathogénicité ont été étudiés : l’atteinte cérébrale, la morbidité et la mortalité. L’atteinte cérébrale a été évaluée par la réalisation quotidienne d’un test d’agrippement (Figure 31). La courbe de résistance a diminué au cours du temps, indiquant que les animaux se sont habitués au test et ont parfois même refusé de s’accrocher à la grille. Néanmoins la comparaison des résultats obtenus avec le groupe contrôle et ceux obtenus avec les différents groupes traités, a montré une différence significative (Test de Duncan, P<0,05) avec le groupe pré-traité par le LPS puis infecté par VACV-WR. De plus, des signes d’atteinte cérébrale ont été observés pour quelques souris infectées et pour toutes les souris pré-traitées au LPS avant l’infection.

Par ailleurs la morbidité et la mortalité des animaux ont été relevées (Figure 32 et 33). Les souris pré-traitées avec le LPS avant l’infection par VACV-WR ont toutes succombé entre le 5ème et le 7ème jours alors que les souris seulement infectées ont toutes survécu, tout comme celles qui n’ont pas été infectées (Test du Log-rank, p<0,0005). Concernant le critère de morbidité, les souris ayant reçu le traitement avec le LPS ont perdu jusqu’à 25 % de leur poids initial après traitement mais celles qui n’ont pas été infectées ont par la suite récupéré un poids similaire à celui des souris du groupe contrôle. A l’opposé, les souris qui ont ensuite été infectées ont continué à perdre du poids atteignant une perte de poids morbide de 30 % (Test de Mann et Whitney, p<0,0005). De même, les souris non pré-traitées avec le LPS mais infectées ont perdu jusqu’à 20 % de leur poids initial à sept jours post-traitement mais ont à la fin de l’étude amorcé une reprise de poids corrélée avec l’absence de mortalité observée dans ce groupe (Test de Mann et Whitney, p<0,0005).

4.2.2.3 Etude de la neuroinvasion du VACV

Pour observer la neuroinvasion du VACV à partir du compartiment sanguin, l’étude précédente a été répétée mais les animaux ont été sacrifiés à différents temps post-traitement. Le virus présent dans le sang prélevé avant perfusion intracardiaque, dans le cerveau et dans la rate des animaux euthanasiés, a été titré par PCR en temps réel (Figure 34). Un groupe témoin d’infection a été euthanasié deux heures p.i. sans perfusion intracardiaque afin de déterminer la charge virale présente dans le compartiment sanguin des différents organes étudiés. Les résultats des titrages ont montré que deux heures après injection par voie intraveineuse de 108 PFU de VACV-WR, environ 103 copies d’ADN viral/mL étaient présentes dans le sang de la souris. Le virus n’a pas pu être détecté dans le tissu cérébral des souris non perfusées alors qu’une importante charge virale était présente dans la rate, qui est un organe où la réplication virale est détectée très rapidement après infection par un OPV (Ferrier-Rembert et al., 2007 ; Karupiah et al., 1993). En effet, le volume sanguin cérébral chez la souris est d’environ 10 µL (2,3 ± 0,4 mL/100 g), or la charge virale dosée dans le sang étant d’environ 1000 copies d’ADN/mL, les 10 copies d’ADN viral estimées dans le sang cérébral total sont en dessous du seuil de détection de la technique (25 copies d’ADN dans l’échantillon total). Concernant les groupes infectés par VACV-WR, le titre viral dans le sang était légèrement supérieur à quatre jours p.i. en comparaison au titre obtenu deux heures p.i. puis il a diminué les jours suivants. Au niveau du tissu cérébral, l’ADN génomique viral était détecté en quantité importante les premiers jours suivant l’infection et la charge virale était significativement plus importante dans le tissu des animaux qui avaient été pré-traités avec le LPS (Test de Student, p<0,005). Cette charge virale a par la suite diminué à partir du 5ème jour p.i. Concernant les titres viraux détectés au niveau de la rate, la différence observée à quatre jours p.i. entre les souris pré-traitées au LPS et les souris directement infectées, est similaire à celle observée au niveau du cerveau (Test de Student, p<0,005). De même, l’évolution de la charge virale suit le même profil que dans le tissu cérébral, avec une diminution du titre à partir du 5ème jour p.i.