Etudes in vivo

I.3.1. Stéréotaxie

La stéréotaxie est une technique utilisée en neurochirurgie pour atteindre des zones du

cerveau de manière précise. La position des différentes structures cérébrales est définie à

partir de l’atlas stéréotaxique (Paxinos G et Watson C, The brain stereotaxic coordinates-2nd

Edition). Avant la chirurgie, les animaux reçoivent une injection sous-cutanée de

buprénorphine (0,03 mg/kg Axience) et de la lidocaïne (50µl, Ceva Santé Animale) à la

surface du crâne pour atténuer la douleur. Sous anesthésie gazeuse (isoflurane), après avoir

fixé la tête de l’animal dans le cadre stéréotaxique (Kopf), la peau du crâne est incisée et l’os

est nettoyé avec de l’eau oxygénée pour permettre la vue des sutures crâniennes.

I.3.1.1. Implantation de canules

Pour les expériences chez le rat, une canule bilatérale est implantée dans le MBH (AP:

-3,4 mm vs. bregma; L: -0,5mm vs. suture sagitale; DV: -9,5mm vs. surface du crâne). Pour

les souris TRPC3

^total

KO, une simple canule est implantée dans le ventricule latéral (AP: -0,5

mm vs. bregma; L: -1,0mm vs. suture sagitale; DV: -2,2mm vs. surface du crâne). Du ciment

dentaire, ancré à la boite crânienne à l’aide deux vis, maintient la canule en place. Après la

chirurgie, les animaux sont réhydratés avec du sérum physiologique injecté en sous-cutané

(souris : 100 µL ; rats : 500 µl). Les animaux sont ensuite placés dans leur cage sur un tapis

chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Tous les animaux ont récupéré leur poids

pré-chirurgie après environ 7 jours. Après récupération, le test de sécrétion d’insuline en réponse

à l’hyperglycémie centrale est réalisé chez le rat et le test de réalimentation en réponse au

glucose icv est effectué chez la souris TRPC3

^total

KO.

I.3.1.2. Génération des souris TRPC3

MBH

KO

Un adénovirus, AAV-Cre-GFP, est utilisé pour induire une recombinaison génétique

dans le MBH des souris TRPC3

^lox/lox

. Le plasmide CBA.nls myc Cre.eGFP exprime la

protéine de fusion myc-nls-Cre-GFP fournie par Richard Palmiter (Université de Washington,

Seattle, USA). Les AAV ayant un sérotype 2/9 (AAV2/9) (∼3-10×10

¹¹

particules virales/ml)

sont fournis par la plateforme de production de virus de UMR INSERM 1089 (Nantes,

150

France). Les souris TRPC3

lox/lox

reçoivent 250 nl d’AAV Cre-GFP (3-10×10

11

particules

virales/ml) ou d’AAV- CMV (contrôle, 5x10

12

particules/ml) de part et d’autre du MBH par

stéréotaxie (AP: -1.4 mm vs. bregma; L: -0.4 mm vs. suture sagitale; DV: -5.4mm vs. surface

du crâne) pour invalider l’expression du canal TRPC3 spécifiquement dans le MBH. Ces

souris sont appelées TRPC3

^MBH

KO.

I.3.2. Test tolérance au glucose (GTT) et à l’insuline (ITT)

Les souris sont préalablement placées en cages individuelles sans nourriture pendant

environ 5h avant les tests de tolérance au glucose et à l’insuline. La tolérance au glucose ou à

l’insuline est mesurée en suivant la glycémie par prélèvement de sang à la queue de l’animal à

t=0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min après injection intra-péritonéal de glucose (2g/kg) ou

d’insuline (0,75U/ml). Les échantillons de plasma sont collectés à t=0, 15, 30 pour mesurer la

sécrétion d’insuline induite par le test de tolérance au glucose par alphaLISA (AL204, Perkin

Elmer).

I.3.3. Sécrétion d’insuline induite par l’hyperglycémie centrale

Le test de la détection centrale de l’augmentation de la concentration de glucose est

toujours réalisé en début d’après-midi suite à une période de 5 heures sans croquettes,

permettant ainsi une stabilisation des glycémies et une homogénéisation des groupes. Le test

est pratiqué sur des animaux anesthésiés (rats, souris TRPC3

^total

KO, TRPC3

^MBH

KO) au

pentobarbital (60 mg/kg). Une incision est pratiquée à la base du cou, les tissus conjonctifs et

musculaires sont dégagés. La carotide est isolée, ligaturée à l'extrémité la plus proche du

coeur. Le cathéter est inséré dans la carotide en direction du cerveau et ligaturé pour le

maintenir en place. Après stabilisation de la glycémie, l'animal reçoit un bolus de glucose

(rat : 9 mg/kg, 100 µl en 30 secondes / souris : 25mg/kg, 30µl en 30 secondes). Des

échantillons de sang sont prélevés au niveau de la queue au temps t=0 min (juste avant

l’injection du bolus de glucose), t=1, 3 et 5 min et la glycémie est mesurée. Ce protocole est

connu pour induire une sécrétion rapide (1 min) et transitoire d’insuline dont la commande est

nerveuse (vagale), sans modification de la glycémie périphérique, ce qui exclu toute

stimulation directe du pancréas par ce métabolite. Les échantillons de sang sont centrifugés à

200 g/min, pendant 7min à 4°C afin d’en récolter les plasmas pour la mesure ultérieure de la

concentration en insuline par alphaLISA (AL204, Perkin Elmer).

151

Pour l’étude pharmacologique chez le rat, 5 min après infusion intra-MBH de Pyr3

(3µM, 1µl en 10 min) pour inhiber l’activité du canal TRPC3 ou de liquide cérébrospinal

artificiel (aCSF, 1µl en 10 min, Tocris) dans le MBH, l’injection du bolus carotidien de

glucose est réalisée. A la fin du test, les rats sont sacrifiés et une solution de bleu de

bromophénol est infusée pour vérifier le bon emplacement de la canule.

Pour les souris TRPC3

^total

KO et TRPC3

^MBH

KO, le MBH est prélevé pour quantifier

les taux d’expression des canaux TRPC par RT-qPCR et vérifier le site d’injection des AAV.

I.3.4. Tests de réalimentation en réponse au glucose

Les souris sont placées en cycle inversé pour mesurer la prise alimentaire durant leur

phase d’activité. Après 18h de jeûne, du glucose ou du sucrose (125µg dans 2 µl en 5 min,

osmolarité similaire) est infusé dans le ventricule latéral des souris éveillées. 30 min après

injection, les croquettes sont réintroduites dans la cage et la prise alimentaire est mesurée

pendant 6h, toutes les 2 heures. A la fin du test, les animaux sont sacrifiés et une solution de

bleu de bromophénol est injectée afin de vérifier le bon emplacement de la canule. La prise

alimentaire a aussi été testée après injection de glucose (2g/kg) ou de NaCl en intrapéritonéal.

I.3.5. Analyses biochimiques

La glycémie est mesurée à partir d’une gouttelette de sang déposée sur une bandelette

d’un lecteur glycémique Performa AccuChek (Roche). L’insulinémie est mesurée en utilisant

un kit alphaLISA ultra-sensible (AL204, Perkin Elmer).

I.3.6. Analyses statistiques

L’analyse statistique est réalisée avec le logiciel Prism 5.0 (GraphPad). Les résultats

sont exprimés sous forme de moyenne ± sem. Des tests de Student (ou des t-tests) appariés ou

non-appariés ont été réalisés pour les comparaisons de deux groupes de données. Pour les

comparaisons multiples, une analyse de variance (ANOVA) à 1 ou 2 paramètres (suivie d’un

post-test de Bonferroni) a été réalisée pour détecter les différences. Les tests utilisés sont

mentionnés dans les légendes des figures. Les différences significatives sont notées *

^#

, **

^##

,

***

^###

sur les figures lorsque les valeurs de « p » étaient respectivement < 0,05 ; 0,01 et

0,001.

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Dans le document Un nouvel acteur dans la détection hypothalamique du glucose : les canaux Transient Receptor Potential Canonical (TRPC) (Page 150-153)