4.8.1 Préparation des blocs d’inclusion
Tous les tissus ou cellules utilisés pour les études d’histologie sont inclus dans du milieu d’enrobage OCT à l’intérieur d’un moule d’inclusion (Leica, Nanterre, France) et congelés rapidement dans de l’azote liquide. Les blocs d’inclusion sont stockés à -80°C.
Les coupes sont réalisées à l’aide d’un cryostat (Leica CM3050S, Leica, Nanterre, France) à 4
µm d’épaisseur pour les coupes de cellules et 7 µm pour celles de tissus. Les coupes sont
récupérées sur des lames SuperFrost® Plus (Labonord) et stockées à -80°C.
4.8.2 Coloration
4.8.2.1 Coloration Hématoxyline / Eosine
La coloration Hématoxyline / Eosine est une coloration histologique topographique, associant une coloration nucléaire par l’hématoxyline de Harris à une coloration des cytoplasmes et du collagène par l’éosine. L'hématoxyline colore les noyaux cellulaires en bleu, et l’éosine quant à elle colore les cytoplasmes en rose et les fibres dans une gamme de roses plus ou moins vifs. En pratique, les coupes sont colorées 30 secondes dans un bain d’hématoxyline de Harris (Labonord) et rincées deux fois à l’eau. Après un bain rapide d’acide-alcool (2 % d’acide chlorydrique dilué dans de l’éthanol 70%), les coupes sont de nouveaux rincées à l’eau. Les lames sont ensuite passées dans un bain d’eau ammoniacale (2 ml d’hydroxyde d’ammonium (Sigma-Aldrich) diluée dans de l’eau distillée), rincées rapidement à l’eau du robinet et colorées 10 secondes avec de l’éosine (Labonord). Les coupes sont rincées à l’eau et déshydratées avec trois bains d’alcool 100% et un passage rapide dans le toluène (Labonord). Enfin les coupes sont montées entre lame et lamelle.
Lobe caudé, processus papillaire Lobe caudé, processus caudé = ELECTROPHORESE 2D = RESONNANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (RMN) = HISTOLOGIE
107 4.8.2.2 Coloration selon la méthode « Alcoholic Periodic Acid-Aqueous Schiff's » adaptée
pour le dextran
Traditionnellement, la coloration avec l’acide périodique de Schiff (PAS) met en évidence les glucides, qu’ils soient neutres ou à fonction acide. Pour ce faire, un agent oxydant, l’acide périodique, rompt les liaisons covalentes entre deux fonctions -OH d'un glucopyranose. Les aldéhydes insolubles créés sont ainsi colorés en rouge par le réactif de Schiff.
Toutefois, dans notre cas, nous cherchons par cette coloration à mettre en évidence les billes de dextran transplantées. Etant donné que le dextran est soluble dans l’eau et que la coloration PAS est effectuée ordinairement avec des réactifs aqueux, nous avons utilisé la méthode « Alcoholic Periodic Acid-Aqueous Schiff's » adaptée par Mowry et Millican pour le dextran (Mowry & al, 1953).
Pour ce faire, les coupes sont passées dans un bain de xylène (Labonord) et d’alcool à 95%. Les coupes sont ensuite traitées 2 heures avec une solution d’acide périodique 1% fraîchement préparée (1g d’acide périodique (Fisher) + 100 ml d’éthanol 90%). Les coupes sont rincées dans un bain d’alcool à 80% et un bain d’eau distillée. Ensuite, les coupes sont traitées pendant 10 min avec le réactif de Schiff aqueux (Sigma-Aldrich) puis rincées trois fois dans une solution de Sodium métabisulfite (Solution mère de sodium métabisulfite (Sigma-Aldrich) à 19% diluée au 20èmependant 60, 120 et 120 secondes. Les coupes sont lavées dans l’eau distillée pendant 5 min et contre-colorées dans l’hématoxyline pendant 90 secondes. Enfin, les coupes sont rincées à l’eau distillée, à l’alcool 100 % et au xylène avant d’être montées sous lame et lamelle.
4.8.3 Marquage immunohistochimique
4.8.3.1 Révélation à la diaminobenzidine (DAB)
Les coupes sont décongelées à température ambiante et fixées avec une solution de paraformaldéhyde 4% (Sigma-Aldrich) pendant 10 minutes. Les coupes sont ensuite rincées dans une solution de «Tris Buffered Saline » (TBS, Bio-rad, Marnes-la-coquette, France). Afin d’inhiber les peroxydases endogènes, les coupes sont incubées dans un bain de peroxyde d’hydrogène 3% (Sigma-Aldrich) pendant 10 minutes. Les sites aspécifiques sont bloqués pendant 1 heure à température ambiante avec du tampon de blocage contenant une solution de TBS supplémentée avec 0,5 % de triton-X 100 (Sigma-Aldrich) et 5 % de sérum normal de chèvre (Thermo Fisher, Fisher). Les coupes sont ensuite incubées pendant la nuit à 4°C en chambre humide avec l’anticorps primaire (Anticorps monoclonal anti-insuline, dilution 1/1000ème, Sigma-Aldrich) dilué dans la solution de blocage. Les sections sont rincées et
108 incubées 1h à température ambiante en chambre humide avec l’anticorps secondaire biotinylé (Sigma-Aldrich) dilué au 1/200ème dans la solution de blocage. Les coupes sont de nouveau lavées et incubées pendant 30 minutes dans une solution d’extradivine peroxydase (Sigma-Aldrich) diluée au 1/20ème dans la solution de blocage. Après un rinçage, les coupes sont incubées 2 minutes dans une solution de révélation contenant 200 µl de 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC ; Sigma-Aldrich), 3,8 ml de tampon acétate (Sigma-Aldrich) et 20 µl d’H2O2 (Sigma-Aldrich). La révélation est stoppée dans un bain d’eau distillée et les coupes sont contre-colorées dans un bain d’hématoxyline (Labonord) pendant 15 secondes. Les lames sont enfin rincées et montées sous lamelles en milieu aqueux (Labonord).
4.8.3.2 Révélation avec des anticorps secondaires fluorescents
Les coupes sont décongelées à température ambiante et fixées avec de l’acétone froid (Fisher) pendant 3 minutes. Les sites aspécifiques sont bloqués pendant 1 heure à température ambiante avec du tampon de blocage contenant une solution de PBS 1x supplémentée avec 0,5 % de triton-X 100 et 5 % de sérum normal de chèvre. Les coupes sont ensuite incubées pendant la nuit à 4°C en chambre humide avec l’anticorps primaire dilué dans la solution de blocage suivant la dilution préalablement déterminée (Fig. 3-10). Les coupes sont lavées avec une solution de lavage (PBS 1x). Elles sont ensuite incubées pendant 1 heure à température ambiante en chambre humide avec l’anticorps secondaire couplé à un composé fluorescent et dilué dans la solution de blocage suivant la dilution préalablement déterminée (Tab. 3-1). Les coupes sont rincées et montées sous lamelles en milieux aqueux (Flurosave™, Merck-Millipore, Molsheim, France). L’utilisation d’un intercalant de l’ADN tel que le 4'-6' diamino-2-phenylindole (DAPI ; Sigma-Adrich) à 0.5 µg / ml est éventuellement effectué avant le montage de la lamelle par une incubation d’1 minute.
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ANTICORPS PRIMAIRES
Antigènes Anticorps Références Fournisseurs Dilutions
Rat - Insuline Monoclonal -
lapin 3014
Cell Signaling Technology®, Ozyme,
Saint-Quentin-en-Yvelines, France
1/100ème
Rat - Insuline Monoclonal -
souris 8138 1/100ème Rat – Monocytes / Macrophages / Granulocytes (OX42) Monoclonal – souris ab1211
Abcam®, Paris, France
1/100ème Rat - Monocytes / Macrophages (ED1) Monoclonal - souris ab31630 1/100 ème
Rat - Thrombine Polyclonal -
lapin ab92621 1/200
ème
Rat - Macrophages (ED2) Monoclonal –
souris MCA342GA
AbD serotec, Colmar, France
1/50ème Rat – Granulocytes (HIS48) Monoclonal– souris MCA967 1/20 ème
Rat – Cellules NK (CD161) Monoclonale -
souris MCA1427 1/50
ème
ANTICORPS SECONDAIRES COUPLES A UN AGENT FLUORESCENT
Couplage Anticorps Références Fournisseurs Dilutions
Alexa 488
Chèvre
anti-souris A-11001
Molecular probes®, Fisher
1/200ème Chèvre anti-lapin A-11034 1/200 ème Cy3 Chèvre anti-souris A-10521 1/1000 ème Chèvre anti-lapin A-10520 1/1000 ème
Tableau 4-1..Récapitulatif des anticorps utilisés pour les études d’immunohistochimie
4.8.4 Marquage des espèces réactives de l’oxygène avec la sonde dihydroéthidium
4.8.4.1 Principe du marquage avec la sonde dihydroéthidium
L'anion superoxyde (O2-) intracellulaire et d'autres radicaux oxygénés peuvent être détectés par la dihydroéthidine (DHE). La DHE est un composé non fluorescent pouvant diffuser à travers la membrane cytoplasmique et qui, sous l'action d'anions superoxyde, s'oxyde rapidement en éthidium fluorescent (excitation= 488 nm; émission = 575nm). L'éthidium va
110 ensuite s'intercaler au niveau des bases azotées de l'ADN nucléaire. Ceci permet sa rétention dans la cellule, et donc la détection par microscopie est réalisable (Saiki & al, 1986).
Afin de caractériser la nature des ROS, l’usage d’inhibiteurs est nécessaire. Le manganese(III) tetrakis(1-methyl-4-pyridyl)porphyrine (MnTMPyP) est un analogue perméant membranaire de la superoxyde dismutase ; il permet de mettre en évidence la présence d’anion superoxydes. La polyéthylène glycol-catalase (PEG-catalase) est un analogue perméant de la catalase, elle permet de mettre en évidence la présence de peroxyde d’hydrogène. En pratique, après traitement avec le MnTMPyP et la PEG-catalase, la fluorescence émise par la DHE est inversement proportionnelle à la quantité d’anions superoxydes (O2-) ou de peroxyde d’hydrogène (H2O2).
4.8.4.2 Protocole du marquage avec la sonde dihydroethidium
Les coupes sont décongelées à température ambiante et délimitées à l’aide d’un stylo hydrophobe (Dako, Dutscher). Les coupes sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 37°C avec une solution contenant la sonde dihydroethidium à 2,5 x 10-6mol.l-1 (Sigma-Aldrich). Les inhibiteurs sont préincubés à 37°C pendant 30 minutes avant l’ajout de la sonde DHE. Ils sont utilisés aux dilutions suivantes : le MnTMPyP à 10-4mol.l-1 (Alexis Biochemicals, Enzo Life science, Villeurbanne, France) et la PEG-catalase à 500 UI / ml (Sigma-Aldrich). La fluorescence émise est visualisée par microscopie à fluorescence