Etude des marqueurs de l’autophagie au cours de l’immortalisation et de la

de la transformation cellulaire par HRAS

Afin d’étudier si l’immortalisation et/ou la transformation des cellules MEF a un impact sur le processus autophagique, l’expression endogène des marqueurs de l’autophagie GABARAPL1, GABARAP et LC3 a été étudiée. L’immortalisation par l’antigène T du virus SV40 et la transformation par HRASG12V conduit à une augmentation du taux de protéines GABARAPL1, GABARAP et LC3 (Figure 27A et B). Par contre, le taux de ces protéines ne varie pas en fonction du nombre de passages (de P1 à P4) dans les cellules MEFp.

Figure 27 : Etude de l’expression des marqueurs de l’autophagie au cours de l’immortalisation et de la transformation. (A)Les cellules MEFp (passage 1 à 4), MEFi et MEFt ont été lysées puis50 •g de protéines ont été séparés sur gel SDS-PAGE 12,5%. La révélation a été réalisée à l’aide d’anticorps dirigés contre les anticorps GABARAP, GABARAPL1 (chemicon), LC3 et actine. (B) Quantification du taux protéique des marqueurs de 1’autophagie. (C) Analyse par qPCR des taux de messagers de gabarapl1. Les valeurs correspondant aux taux d’ARNm ont été normalisées par rapport aux valeurs obtenues pour l’ARNr 18S. p* <0,05 par rapport à la lignée MEFi.

Afin de vérifier si l’augmentation de GABARAPL1 au cours de la transformation est due à une augmentation du taux de messager, nous avons étudié le taux de messager GABARAPL1 dans les cellules MEFi et MEFt WT (Figure 27C). Une forte augmentation de l’ARNm

GABARAPL1 (X10) est observée dans les cellules MEFt WT comparativement aux cellules

MEFi WT. Une étude similaire devra être réalisée afin d’étudier les taux de messagers

GABARAP et LC3.

IV. ETUDE DU PROTEOME GLOBAL DES LIGNEES

SUREXPRIMANT GABARAPL1 OU GABARAPL1 G116A

En parallèle, une étude du protéome global de nos lignées MCF-7 C, GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A a été entreprise par spectrométrie de masse en collaboration avec la

plateforme protéomique CliPP (CLinical and Innovation Proteomic Platform,

Bourgogne/Franche-Comté). L’analyse du protéome permettra d’établir une cartographie protéique complète des lignées surexprimant GABARAPL1 ou GABARAPL1 G116A permettant ainsi d’identifier les protéines et voies moléculaires régulées par GABARAPL1 de manière dépendante ou non de sa glycine en position 116.

Les échantillons protéiques de nos différentes lignées cellulaires (10 µg de protéines totales) ont été chargés sur un gel 15% qui a ensuite été coloré avec une solution de coloration appelée Blue Silver (Figure 28). A première vue, la surexpression de GABARAPL1 ou GABARAPL1 G116A ne modifie pas le protéome global, il a donc été nécessaire d’étudier plus précisément les protéines minoritaires. Dans un premier temps, les zones 3, 5 et 7, présentant les bandes les plus intenses, ont été exclues tandis que les zones 1, 2, 4, 6 et 8, présentant les bandes de plus faible intensité ont été découpées et utilisées pour la suite de l’analyse.

Figure 28 : Protéome global des lignées cellulaires MCF-7 C, GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A. Les protéines

totales (10µg) extraites des différentes lignées cellulaires ont été chargées sur un gel SDS-PAGE 15%. Les protéines ont été colorées à l’aide du réactif Bleu Silver pendant 2h puis décolorées avec de l’eau distillée. Les zones 1, 2, 4, 6 et 8 ont ensuite été découpées et utilisées pour la suite des analyses.

L’analyse protéomique a permis d’identifier de très nombreuses protéines par zone

(Tableau 6). Une différence au niveau du nombre de protéines identifiées peut être observée

entre nos différentes lignées. En effet, la surexpression de GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A conduit à une diminution du nombre total de protéines sur l’ensemble des bandes étudiées : 2478 et 2132 protéines observées respectivement, comparativement à 3247 protéines pour les cellules C. Ces observations suggèrent que la surexpression de GABARAPL1 ou GABARAPL1 G116A favorise la dégradation de protéines. Ces différences ne semblent pas être liées à la quantité initiale de protéines utilisée puisque ces différences ne sont pas linéaires d’un échantillon à un autre. Les contrôles adéquats ont été réalisés et indiquent que ces différences ne sont pas non plus en lien avec un biais analytique ou une contamination et ont donc un sens biologique.

Tableau 6 : Nombre de protéines identifiées dans les lignées MCF-7 C, GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A en fonction des zones étudiées.

L’analyse en spectrométrie de masse a permis l’obtention de données brutes indiquant le nombre de peptides de nombreuses protéines (environ 4500) présents dans chacune de nos lignées cellulaires (Figure 29A). Le nombre de peptides rend compte de la quantité de la protéine dans chacune de nos lignées cellulaires.

Figure 29 : Méthode d’analyse préliminaire des résultats de spectrométrie de masse. (A) Obtention de données brutes

présentant le nombre de peptides de chaque protéine dans les différentes lignées cellulaires. (B) Comparaison du nombre de peptides dans les différentes lignées cellulaires par le calcul de ratios. (C) Comparaison des ratios obtenus permettant l’identification des protéines régulées de manière dépendante ou indépendante de la localisation de GABARAPL1 au niveau des autophagosomes.

Afin d’identifier les protéines régulées par GABARAPL1 de manière dépendante ou indépendante de sa localisation au niveau des autophagosomes, nous avons comparé le nombre de peptides des différentes protéines présentes dans nos lignées MCF-7 C, GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A à l’aide de ratios (Figure 29 B). L’analyse de ces ratios nous a permis de mettre en évidence 4 familles différentes de protéines en fonction de leur schéma de régulation : i) les protéines augmentant lors de la surexpression de GABARAPL1 (11,5%), ii) les protéines augmentant lors de la surexpression de GABARAPL1 et GABARAPL1 G116 (2,3%), iii) les protéines diminuant lors de la surexpression de GABARAPL1 (8,7%) et iii) les protéines diminuant lors de la surexpression de GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A (25%)

(Figure 29C). La surexpression de GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A conduit

majoritairement à une diminution de l’expression des protéines (25%), confirmant que GABARAPL1 est principalement impliquée dans des processus de dégradation tels que l’autophagie. Le Tableau 7 présente des exemples de protéines impliquées dans l’autophagie et les fonctions lysosomales et étant régulées dans nos lignées de surexpression de GABARAPL1 et GABARAPL1 G116A.

Tableau 7 : Exemple de protéines impliquées dans l’autophagie et les fonctions lysosomales régulées dans les cellules surexprimant GABARAPL1 ou GABARAPL1 G116A. Les ratios indiqués en rouge représentent une diminution des

protéines dans les lignées surexprimant GL1 ou GL1 G116A tandis que les ratios indiqués en vert représentent une augmentation des protéines dans les lignées surexprimant GL1 ou GL1 G116A.

Les données obtenues par spectrométrie de masse permettent de mettre en évidence que de nombreuses protéines sont régulées lors de la surexpression de GABARAPL1 que ce soit de

Fonctions Protéines Ratio

C/GL1 Ratio C/G116A Ratio GL1/G116A GL1 GL1 G116A Autophagie ULK2 8000 8000 1 S10A8 7000 7000 1 AKT1 7000 7000 1 EPG5 6000 6000 1 RAB1B 7000 1 7000 B2CL1 2000 1 2000 BAD 0,0005 1 0,0005 LAMP1 0,0003 1 0,0003 Lysosome PPT1 13000 13000 1 CTR9 4000 4000 1 GCC2 2000 2000 1 FNBP1 2000 2000 1 COR1A 8000 8000 1 CYTC 2000 1 2000

manière dépendante ou indépendante de sa localisation au niveau des autophagosomes. Une étude plus approfondie de l’ensemble des résultats obtenus sera nécessaire afin d’identifier toutes les voies moléculaires régulées dans nos lignées cellulaires et afin d’établir la significativité des résultats. Une analyse biostatistique est en cours sur 3 expériences indépendantes. Une analyse bioinformatique est également en cours afin d’identifier les voies métaboliques et les voies moléculaires régulées suite à la surexpression de GABARAPL1 ou GABARAPL1 G116A. Les protéines identifiées comme étant régulées par GABARAPL1, de manière dépendante ou indépendante de sa localisation au niveau des autophagosomes, fourniront de nouvelles pistes à explorer pour mieux comprendre le rôle de GABARAPL1 dans l’autophagie mais également dans d’autres mécanismes.

DISCUSSION ET

PERSPECTIVES

L’ensemble de mes travaux de thèse a consisté en l’étude du rôle de deux protéines QSOX1 et GABARAPL1 dans l’autophagie et le cancer, deux mécanismes étroitement liés. Ces travaux de thèse ont permis d’étudier le rôle de QSOX1 et GABARAPL1 dans l’autophagie et de déterminer l’implication de l’autophagie dans les fonctions liées aux cellules cancéreuses de ces deux protéines. Ces travaux ont permis de mieux caractériser et d’identifier des liens entre autophagie, stress cellulaire, métabolisme et cancer.