Effet de l’invalidation de GABARAP au cours de la transformation

1.1. Caractérisation du modèle d’invalidation de GABARAP (MEFi GABARAP -/-₎

Des études antérieures ont mis en évidence que l’invalidation des gènes ATG5 ou ATG7 perturbe la transformation des cellules MEF par l’oncogène HRASG12V _{(Lock et al., 2011).} Nous avons donc voulu étudier l’effet de l’invalidation de gabarap au cours de la transformation. Tout d’abord, nous avons validé la lignée cellulaire MEFi GABARAP-/- disponible au sein de notre laboratoire en étudiant l’expression des protéines SV40 et GABARAP (Figure 19). L’antigène T de SV40 est exprimé très fortement dans les cellules MEFi WT et MEFi GABARAP-/- _{tandis que la protéine GABARAP est exprimée uniquement} dans les cellules MEFi WT mais pas détectée dans les cellules MEFi GABARAP-/- _confirmant Figure 18 : Analyse de l’expression des protéines GABARAP et GABARAPL1 dans les lignées MEFp et MEFi. 50 µg de protéines ont été séparés sur gel SDS-

PAGE 12,5%. La révélation a été réalisée à l’aide d’anticorps dirigés contre les protéines GABARAP, GABARAPL1 (Chemicon) et actine.

l’invalidation de GABARAP dans cette lignée.

1.2. Obtention et caractérisation des lignées stables MEFt WT et MEFt GABARAP - /-

Afin d’étudier le rôle de GABARAP dans la transformation cellulaire, des cellules MEFi WT et MEFi GABARAP-/- ont été transfectées de manière stable par les plasmides pBABE vide (contrôle) et pBABE-HRASG12V. Ce dernier conduit à l’obtention de cellules MEF surexprimant HRASG12V appelées MEFt WT et MEFt GABARAP-/- qui permettront l’étude de la transformationcellulaire induite par cet oncogène.

Les clones obtenus ont d’abord été validés au niveau de l’ADN génomique. La présence du gène HRASG12V a été étudiée par PCR en utilisant une amorce sens interne au gène HRASG12V et une amorce anti-sens située dans le vecteur pBABE. Ces amorces permettent de détecter Figure 19 : Validation des modèles cellulaires MEFi WT et MEFi GABARAP-/-_{. 60 µg de protéines ont été séparés sur gel SDS-PAGE 12,5%.}

La révélation a été réalisée à l’aide d’anticorps dirigés contre les protéines SV40, GABARAP et actine.

Figure 20 : Analyse génomique des clones stables isolés provenant de la transfection stable par pBABE-HRASG12V des lignées MEFi WT et GABARAP-/-_{. Electrophorèse sur gel d’agarose 1% des produits PCR obtenus à l’aide des}

amorces HRASG12V _{sens et pBABE3 rev à partir d’ADN génomique (pistes 4-16). Piste 1, 1 Kb+ ladder (Invitrogen). Piste}

ont ensuite été analysés par électrophorèse en gel d’agarose (Figure 20). Une bande de taille attendue (200 pb) a été obtenue pour les clones 2 et 4 de la lignée MEFt WT (piste 5 et 7) et pour les clones 1 à 6 de la lignée MEFt GABARAP-/- _{(piste 10 à 15). Le clone 2 MEFt WT et} les clones 3 et 6 MEFt GABARAP-/- ont été retenus pour la suite des expériences.

L’expression de HRASG12V a ensuite été analysée au niveau protéique dans nos lignées MEFi et MEFt WT et GABARAP-/- cl6 (Figure 21). L’anticorps utilisé ne permet pas de discriminer la forme endogène HRAS murine de la forme exogène HRASG12V mutée humaine. Le signal observé à 21 kDa correspond donc au cumul des deux formes. La protéine HRAS est plus fortement exprimée dans les cellules MEFt WT et GABARAP-/- cl6 comparativement aux cellules MEFi WT et GABARAP-/- démontrant l’expression protéique de HRASG12V dans les lignées MEFt.

D’un point de vue morphologique, la lignée MEFi WT est fusiforme alors que la lignée MEFi GABARAP-/- présente une forme plus allongée avec de longs prolongements cellulaires. Après transformation par HRASG12V, les lignées MEFt WT et GABARAP-/- cl3 et cl6 présentent une morphologie plus étoilée (Figure 22).

Figure 21 : Analyse de l’expression de la protéine HRASG12V _{dans les lignées MEFi et MEFt WT et} GABARAP -/- cl6. (A) 50 •g de protéines ont été

séparés sur gel SDS-PAGE 12,5%. La révélation a été réalisée à l’aide d’anticorps dirigés contre les protéines HRAS et actine. Cette image est représentative de 3 western-blots réalisés à partir de 3 extractions de protéines différentes. (B)

Quantification du taux de protéines HRAS. L’actine a été utilisée comme témoin de normalisation.

Figure 22 : Observation morphologique des lignées MEFi et MEFt WT et GABARAP-/-_{. Photographies au microscope à}

Afin d’étudier l’effet de l’invalidation de GABARAP dans les lignées MEFt au cours de la transformation par HRASG12V, les principaux phénotypes tumoraux ont été étudiés dans nos lignées MEFi et MEFt WT et GABARAP-/- _{(Figure 23 et Figure 24). Nous avons d’abord} étudié la prolifération de nos différentes lignées cellulaires MEFi WT et GABARAP-/- et MEFt WT et GABARAP-/- cl3 et cl6 par test MTT (Figure 23A). Comme attendu, la lignée MEFt WT prolifère beaucoup plus vite que la lignée MEFi WT. Lorsque GABARAP est invalidé, l’effet de la transformation par HRASG12V est diminué.

Cette augmentation de la prolifération dans les différentes lignées est bien due à une augmentation du nombre de cellules vivantes et non à une diminution de la mort cellulaire Figure 23 : Prolifération et clonogénécité des cellules MEFi et MEFt WT et GABARAP-/- _{cl3 et cl6. (A) Les cellules}

MEFi et MEFt ont été ensemencées en plaques 96 puits à raison de 300 cellules par puit. Chaque jour la plaque a été soumise au test MTT. Les résultats correspondent à la moyenne de 16 puits par expérience pour chaque lignée. Les données indiquent la moyenne ± SD * : p <0,05, significativité par rapport à la lignée MEFt GABARAP-/-_{. (B) Etude de la capacité des cellules}

à former des nouvelles colonies. Les cellules MEFi et MEFt WT et GABARAP-/- _{ont été ensemencées à raison de 200 cellules}

par puit et cultivées pendant 7 jours. Les cellules ont été fixées et marquées au crystal violet. Les cellules ont été observées au microscope à contraste (X100) et les colonies ont été comptées à l’aide du logiciel VisionCapt. Les histogrammes représentant la moyenne ± SD. * : significativité par rapport au contrôle (p < 0,05 ; Test t de Student). Ces résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes.

d’après un test d’exclusion au bleu Trypan permettant de quantifier la proportion des cellules mortes (Données non présentées).

Figure 24: Migration, croissance indépendante de l'ancrage et activité des métalloprotéases des lignées MEFi et MEFt WT et GABARAP-/-_{. (A) Etude de la migration cellulaire en chambre de Boyden des lignées MEFt GABARAP}-/- _{cl3 et cl6.}

Photographies des cellules situées sur la face inférieure des membranes après 24 heures d’incubation et histogramme représentant la moyenne ± SD des cellules ayant migré (comptage sur 5 champs). Ces résultats sont représentatifs d’une expérience réalisée en duplicat.* : significativité par rapport au contrôle (p < 0,05 ; Test t de Student). (B) Etude de la croissance indépendante de l’ancrage sur la lignée MEFt GABARAP-/- _{cl6. Photographies au microscope à contraste de phase (X100) et}

histogramme représentant la moyenne du nombre de colonies > 100 •m (comptage sur 10 champs). Ces résultats sont représentatifs de deux expériences indépendantes. Les données indiquent la moyenne ± SD. * : significativité par rapport au contrôle (p<0,05 ; n=10 ; Test t de Student). (C) Etude par zymographie de l’activité protéolytique des métalloprotéases dans la lignée MEFt GABARAP-/- _{cl6. Photographie d’un gel d’acrylamide 1% gélatine après coloration (bleu de Coomassie) et}

Des résultats similaires ont été obtenus lors de l’étude d’autres phénotypes cancéreux tels que la clonogénécité (Figure 23B) et la migration cellulaire (Figure 24A) pour les lignées MEFt GABARAP-/- _{cl3 et cl6 mais également la croissance indépendante de l’ancrage (Figure}

24B) et l’activité des métalloprotéases (Figure 24C) pour la lignée MEFt GABARAP-/- cl6. En effet, la lignée MEFt WT présente une augmentation des phénotypes cancéreux comparativement à la lignée MEFi WT. Comme précédemment, lors de l’invalidation de

GABARAP, HRASG12V conduit à une augmentation des phénotypes cancéreux mais dans une moindre mesure comparativement aux cellules MEFt WT suggérant que l’invalidation de

GABARAP perturbe la transformation cellulaire par HRASG12V.

2. Mise en place de modèles cellulaires de surexpression de GABARAPL1