Etude de la localisation subcellulaire d’un DGLE chez le parasite Apicomplexe

Plasmodium falciparum au cours de sa phase érythrocytaire

La localisation subcellulaire du DGLE a été analysée par microscopie à épifluorescence (Matériel et Méthodes). La mise au point d’un protocole de microscopie pour P. falciparum s’est avérée délicate, en particulier l’établissement des conditions de fixation (et de perméabilisation). En effet, il convient d’éviter au maximum l’utilisation de détergents ou de solvants des lipides, l’épitope des anticorps utilisés étant de nature lipidique. La méthode la plus appropriée développée au cours de ce travail est décrite dans la section Matériel et Méthodes.

Après marquage avec l’anticorps anti-DGDG2 visualisé à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, puis marquage en présence de l’intercalant de Hoechst (Figure 28), le signal émis en immunofluorescence indirecte est analysé par comparaison avec les structures cellulaires détectées en contraste de phase. L’ajout d’intercalant de Hoechst permet de visualiser l’ADN nucléaire et contribue à différencier les parasites dans leurs différents stades de développement. Ainsi, au cours de ce travail, les phases du cycle érythrocytaire ont été distinguées de la façon suivante :

- Les stades anneaux, de petite taille et mononucléés, caractérisés par l’absence de pigment hémozoïne.

- Les stades trophozoïtes, de tailles variables, mais toujours mononucléés. Ils synthétisent un pigment : l’hémozoïne, qui apparaît blanc en contraste de phase.

- Les schizontes, plurinucléés et occupant l’ensemble du cytoplasme du globule rouge. Lors de leur éclatement, ils libèrent les mérozoïtes.

Figure 28 : Localisation d’un épitope de structure proche du DGDG détecté par immunomarquage chez les formes érythrocytaires asexuées de Plasmodium falciparum. Des cultures asynchrones d’érythrocytes

infectés par P. falciparum ont été fixés, perméabilisés et incubés en présence d’anti-DGDG2, d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, puis du réactif de Hoechst. (A) Parasite en stade anneau. Le DGLE est localisé à une zone marginale du parasite. (B) Parasite en stade trophozoïte. Le DGLE est détecté en périphérie du parasite par des signaux ponctuels. (C-F) Parasite en stade schizonte. Chez les schizontes plus jeunes (C), comme pour les trophozoïtes, le DGLE semble localisé en périphérie ; chez des schizontes plus âgés, ces signaux ponctuels se retrouvent dans toute la cellule. Un signal moins intense semble marquer la périphérie des futurs mérozoïtes.

Au cours des 3 stades parasitaires asexués de la phase érythrocytaire, la distribution du DGLE détecté par l’anti-DGDG2 évolue. Ainsi, chez le parasite en stade anneau (Figure 28 A), le DGLE est détecté sous forme d’un signal marginal périphérique très localisé et intense. Lors de l’évolution en stade trophozoïte (Figure 28 B), le DGLE se distribue en signaux ponctuels en périphérie du parasite, ce qui semble être aussi le cas de façon plus marquée en stade schizonte

(Figure 28 C). Chez les schizontes tardifs, en plus des signaux ponctuels, le DGLE semble être redistribué dans les membranes des mérozoïtes en formation.

A cette échelle de grossissement, la localisation fine dans des compartiments membranaires est difficilement appréciable. La nature exacte des structures observées doit donc être évaluée au moyen de techniques microscopiques plus performantes en termes de résolution. L’utilisation de marqueurs spécifiques de divers compartiments parasitaires, en comarquage, ainsi que le passage à des techniques telles que l’analyse de plans déconvolués ou la microscopie électronique sur P. falciparum semblent donc constituer une étape indispensable à une localisation plus précise de cet épitope.

Afin d’observer de façon plus fine la localisation du DGLE chez P. falciparum, particulièrement au cours du stade schizonte, des séries de prises de vue en plan Z (dans la profondeur de l’échantillon) ont donc été effectuées sur des préparations identiques à celles observées en immunofluorescence indirecte. Les séries ont été déconvoluées comme il est décrit dans la section Matériel et Méthodes.

Figure 29 : Localisation d’un épitope de structure proche du DGDG chez les formes asexuées de P. falciparum après déconvolution. (A) Parasite au stade trophozoïte. Le

DGLE est détecté par un signal ponctuel périphérique identique au signal observé en immunofluorescence classique.

(B) Parasites au stade jeune schizonte. Alors que le noyau

se divise, le signal ponctuel évolue en plaques périphériques.

(C) Parasite au stade schizonte. L’analyse fine du signal

montre une redistribution du marquage au niveau des membranes des mérozoïtes. (D) Parasites libérés au cours

de l’éclatement du globule rouge. L’épitope est localisé en

périphérie des parasites de façon non uniforme autour des mérozoïtes.

Au cours de la formation des mérozoïtes au sein du schizonte, l’épitope réagissant avec l’anticorps anti-DGDG2 est d’abord localisé de façon ponctuelle autour du parasite (Figure 29 A), puis migre en plaques périphériques chez le jeune schizonte (Figure 29 B), pour se redistribuer en périphérie des mérozoïtes en formation (Figure 29 C et D).

Les résultats des marquages observés en immunofluorescence indirecte montrent des localisations identiques avec les trois anticorps anti-DGDG1, anti-DGDG2 et anti-DGDG3(Figure 30). Cependant, pour obtenir un signal d’intensité semblable, le titrage de l’anticorps anti-DGDG3 doit être

augmenté par rapport aux autres anticorps (anti-DGDG3 est couramment dilué au 1/10ème, tandis que anti-DGDG1 et anti-DGDG2 sont couramment utilisés au 1/25ème).

Figure 30 : Marquages de parasites P. falciparum par les trois anticorps anti-DGDG à des stades de développement proches. (A) Marquage anti- DGDG1 chez un jeune schizonte. (B) Marquage anti-DGDG2 chez un trophozoïte mature. (C) Marquage anti-DGDG3 chez un jeune schizonte.

Dans tous les cas un signal périphérique similaire est observé.

Afin de localiser plus finement le DGLE chez P. falciparum, nous avons souhaité passer à l’échelle de l’observation par microscopie électronique. Des expériences de marquage en présence des anticorps anti-DGDG1, anti-DGDG2 et anti-DGDG3 ont été réalisées sur coupes de P. falciparum (coupes ultrafines sur échantillons inclus en résine LR white et sur échantillons congelés). Le marquage secondaire a été réalisé avec de la protéine A couplée à des particules d’or. Les coupes ont alors été observées en microscopie électronique. En dépit d’essais répétés et de nombreuse préparations (modifiant les méthodes de fixation, de coupe, d’inclusion et les résines), aucune expérience de marquage en présence des anticorps anti-DGDG1, anti-DGDG2 et anti-DGDG3 n’a permis de déterminer de localisation spécifique chez P. falciparum en microscopie électronique. Un marquage cytoplasmique et nucléaire diffus a pu être observé, mais ne correspondait pas à un signal spécifique. Il est à noter que l’épitope qui fait l’objet de ce travail étant vraisemblablement un lipide, de nombreuses biais peuvent expliquer ces difficultés: lors de la fixation (la plupart des fixateurs sont des solvants des lipides), lors de la coupe (l’épitope étant supposé membranaire, il est attendu que l’inclusion de l’échantillon, puis sa coupe réduisent très fortement la biodisponibilité de l’épitope pour un marquage par un anticorps).

La lignée de P. falciparum utilisée lors de ces expériences de marquage (lignée 3D7) possède la capacité se différencier en gamétocytes. Ces stades sexués sont plutôt rares en cultures, leur forme est oblongue et leur taille plus importante que celle des autres stades sanguins (2 à 3 fois). Le complexe membranaire interne est particulièrement développé chez les gamétocytes. La Figure 31 montre un gamétocyte observé par immunofluorescence, issu d’une préparation de culture mixte de parasites lors d’un marquage avec l’anticorps anti-DGDG1.

Figure 31 : Localisation d’un épitope de structure proche du DGDG chez le gamétocyte de P. falciparum. L’épitope se

distribue de façon ponctuelle en périphérie du parasite. Un signal peut être observé au niveau de structure(s) intracellulaire(s) qui reste(nt) à définir. La micrographie montre vraisemblablement un gamétocyte mâle en stade IV-V de la gamétocytogénèse.

Chez le gamétocyte, le signal correspondant au DGLE est distribué à la périphérie du parasite sous forme de points, de façon comparable au signal observé chez les formes érythrocytaires asexuées. Un marquage additionnel, intracellulaire indique une localisation de l’épitope au niveau d’un ou plusieurs organites du parasite. Il serait intéressant de déterminer la nature de cet organite.

La mise au point d’un protocole d’enrichissement en gamétocytes des cultures de souche 3D7 (Matériel et Méthodes) a permis d’affiner la localisation de l’épitope chez ce stade parasitaire lors des différents stades érythrocytaires sexués du parasite avec l’anti-DGDG1 et l’anticorps anti-DGDG2. Les résultats obtenus sont similaires avec l’anti-DGDG1 (non montré) et l’anticorps anti-DGDG2 (Figure 32).

Figure 32 : Localisation d’un épitope de structure proche du DGDG chez des gamétocytes à divers stades de développement. (A) Gamétocyte de P. falciparum en stade IV. Le marquage à l’anti-DGDG2 apparaît

comme périphérique et ponctuel, situé à proximité ou au niveau d’une membrane périphérique. (B) Gamétocyte

femelle de P. falciparum en stade V. (C) Gamétocyte mâle de P. falciparum en stade V. Chez les

gamétocytes en stade V de développement, l’épitope est distribué de façon semblable, en périphérie du parasite ainsi que sous forme d’une ponctuation plus fine et régulière qui semble suivre un trajet éventuellement défini par un ou des éléments du cytosquelette.

La Figure 32 montre qu’un signal périphérique est observé pour l’ensemble des gamétocytes. Chez les gamétocytes les plus matures, une ponctuation plus fine et régulière est observable, dont la structure globale semble former une réticulation en surface du parasite, probablement définies par un ou des éléments du cytosquelette. Pour certains parasites, comme sur la Figure 31, le DGLE est aussi

détecté à l’intérieur des cellules au niveau d’une structure dont la nature exacte n’a pu être définie (non présenté).

B. Etude de la localisation du DGLE chez la forme invasive de Plasmodium berghei