Etude de l’hépatotoxicité par les méthodes classiques chez le rat

Les extraits des graines de Nigella sativa testés dans cette étude sont l’huile totale, les fractions polaire et neutre de l’huile totale. Des rats Wistar femelles âgés de 10 semaines et pesant approximativement 180 g ont étés obtenu de l’animalerie du laboratoire de toxicologie et pharmacologie du CRD (centre de recherche et de développement) du groupe pharmaceutique Saidal (El mohamadia, Alger). Ces rats sont mis dans des cages inoxydables et sont adaptés au milieu environnemental et aux conditions du laboratoire pendant 21 jours

avant l’expérimentation. L’induction du diabète est réalisée selon la méthode de Massiello et ses collaborateurs avec quelques modifications (Massiello et al. ,1998).

4.2.1. Déroulement de l’expérience.

Les rats sont répartis en sept groupes différents. Chaque groupe est soumis à un traitement particulier selon le schéma, représenté par la figure 30. L’administration des traitements à été effectuée au 4emejour après l’induction du diabète. Durant l’expérience, les rats sont nourris par une alimentation standard et avec de l’eau ad. libitum. La démarche expérimentale est expliquée sur la figure suivante :

Pancréas, Foie Transaminases

Bilirubine totale Phosphatase alcaline γ- GT

Figure 29:Protocole utilisé pour l’étude de l’hépatotoxicité chez des rats rendus diabétiques 7 Rats diabétiques traités par la thymoquinone (25mg/kg/j) 7 Rats diabétiques traités par l’huile neutre (100 mg/kg/j) 7 Rats diabétiques traités par l’huile polaire (100 mg/kg/j) 7 Rats diabétiques traités par l’huile totale (100 mg/kg/j) 7 Rats diabétiques Suivi de 17 jours G7 G6 G4 G3 G 2 G 1 G5 Prélèvement du sang : pour dosage Des paramètres hépatiques. Prélèvement d’organe :

pour étude histo- pathologique. 5 Rats témoins normaux sans traitement 7 Rats diabétiques traités par metformine (25mg/kg/j)

4.2.2. Prélèvement sanguin

Les rats sont mis à jeun la vielle du prélèvement après anesthésie à l’éther. Le sang est prélevé par ponction dans le sinus rétro-orbital à l’aide d’une pipette pasteur héparinée. Un léger mouvement rotatoire de la pipette perforant le sinus permet au sang de remonter par capillarité dans celle-ci. Le sang ainsi prélevé est recueilli dans des tubes à hémolyse héparinés. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 15 minutes, le plasma recueilli est fractionné en aliquotes dans des tubes eppendorff et conservés à -20°C en vue du dosage des différents paramètres hépatiques.

4.2.3. Dosage des marqueurs hépatiques.

Au quatrième jour après l’administration de la N/STZ, nous avons confirmé l’installation du diabète par le dosage de la glycémie par la méthode de glucose oxidase (kit de Elitech Diagnostic, France). Au 17èmejour de l’expérience, tous les rats ont été soumis au jeun durant une nuit. Le lendemain, le prélèvement sanguin a été effectué afin de réaliser le dosage des marqueurs hépatiques. Ainsi, tous les marqueurs sont dosés avec les kits spinreact (Espagne) : les taux des transaminases l’alanine aminotransferase (ALAT ou TGP) et l’aspartate aminotransferase (ASAT or GOT) ont été dosés selon la méthode décrite par Bergmeyer (Bergmeyer et al., 1978). Le taux de la gamma-glutamyl transpeptidase (γGT) est déterminé selon la méthode de Szass (1969). La billuribine totale est dosée selon la méthode de Jandrassik-Grof (Jendrassik et Grof, 1938), modifiée par Dumas (Dumas et al., 1973) et Finalement, la phosphatase alkaline (PA) a été déterminée selon la méthode de Hausmen et ses collaborateurs (Hausmen et al., 1967).

4.2.4. Prélèvement d’organes.

Le prélèvement d’organe s’est effectué selon le protocole du laboratoire de pharmacologie- toxicologie du CRD du groupe pharmaceutique SAIDAL. Les organes prélevés ont été, immédiatement, conservés dans le formol à 10% puis transportés au service de bio-pathologie de l’institut pasteur d’Alger pour l’étude histo-pathologique.

- Préparation de l’animal à l’autopsie

L’animal est mis à jeun la veille de l’autopsie. Le lendemain, il est sacrifié en le mettant sous une cloche en verre contenant un coton imbibé d’éther. L’animal est fixé en décubitus dorsal, sur une plaque en liège, les quatre membres attachés en abduction. Une petite incision est pratiquée au niveau du périnée puis une seconde incision est pratiquée du point de la première incision jusqu’au menton (Figure 31). Deux autres lignes d’incision perpendiculaires à la

première sont réalisées. Le dépouillement est réalisé à l’aide d’un bistouri en dilacérant le tissu conjonctif sous cutanée.

Figure 30:Autopsie de la cavité abdominale

- Autopsie de la cavité abdominale

Une incision longitudinale est réalisée le long de la ligne blanche de la pointe xiphoïdienne jusqu'à la symphyse pubienne et par deux incisions transversales en partant de la pointe xiphoïdienne jusqu’à l’hypochondre. Les deux pans de la paroi abdominale, vont être ensuite rabattus vers l’extérieur

Le prélèvement est réalisé rapidement afin d’éviter toute dessiccation des organes. Ces organes sont mis, très rapidement, dans la solution de fixation (2-3 minutes entre le prélèvement et la mise en fixation). Le volume du fixateur est 10 fois supérieur au volume de la pièce anatomique.

4.2.5. Etude histo-pathologique.

L’étude histo-pathologique a été effectuée au laboratoire de bio-pathologie de l’Institut Pasteur Algérie, selon le protocole expérimental du laboratoire qui consiste en :

a) Déshydratation des prélèvements : les organes prélevés sont baignés dans 3 bains successifs concentrés d’éthanol, puis dans 3 bains successifs concentrés de xylène afin d’éliminer toute trace d’alcool.

b) Enrobage à la paraffine : l’inclusion est faite dans deux bains successifs de paraffine liquide pour que cette dernière s’infiltre dans les échantillons. Une fois la paraffine refroidie, on obtient un bloc qui sera facilement coupé.

c) Confection des coupes au microtome : le bloc est placé sur la base d’un microtome, appareil muni d’un couteau et d’un mécanisme d’avancement de sa base, qui permet de trancher le bloc à l’épaisseur désirée. Dans notre cas l’épaisseur est de 3-4µm. Les coupes obtenues sont montées sur des lames de verre préalablement recouvertes de gélatine puis sont séchées.

d) Déparaffinage : les coupes montées sur lames et séchées sont déparaffinées dans du xylène, réhydratées dans des bains successifs d’éthanol de moins en moins concentrés puis rincées avec de l’eau.

e) Coloration : effectuée en utilisant une combinaison entre deux colorants l’hématoxyline et éosine (HE).

f) Montage permanent entre lame et lamelle : ce montage permet de conserver les coupes colorées. Elles sont recouvertes d’une mince lamelle de verre ou de plastique scellée avec une colle.

g) Observation au microscope optique: l’observation a été pratiquée à l’aide un microscope optique doté d’un appareil photographique. Des photographies ont été prises pour chaque prélèvement.