Etude de la fraction saponifiable de 1 Analyse des acides gras

a. Obtention des esters méthyliques des acides gras

Avant de faire des acides gras par chromatographie en phase gazeuse (CPG), il est nécessaire de les convertir en dérivés non polaires à faible poids moléculaire : des esters méthyliques. des acides gras par CPG est possible par la détermination du temps de rétention par comparaison avec celui mélange d acides gras témoins. Les esters méthyliques sont produits par une méthode de saponification à froid selon la méthode de Christie (1998).

Environ 3 gouttes sont reprises par 1ml dans un tube et le contenu est agité

pendant 2secondes tout en maintenant le tube bouché. 0,2ml de NaOH méthanolique (2mol/l) est ajouté et le tube est agité vigoureusement pendant 10 secondes, ensuite placé dans un bain marie à 50°C pendant 20 secondes tout en continuant de maintenir le bouchon fermé. Après ce délai, le tube est agité encore une fois pendant 10secondes puis 0,4 ml méthanolique (1mol/l) est ajouté suivi agitation. Après décantation, la phase organique contenant les esters méthyliques est recueillie et diluée 10 fois dans de puis transvasée vers le flacon de la chromatographie en phase gazeuse.

b. Analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse

Les esters méthyliques sont analysés par chromatographie en phase gazeuse à e chromatographie de type: Shimadzu série 17 A chromatograph. Le mélange à analyser est introduit au moyen d'une seringue dans un premier four chauffé aux environs de 250°C : la chambre d'injection. Le mélange se volatilise dans la chambre et passe dans le circuit sous forme de gaz. Le mélange gazeux est ensuite entraîné par le gaz vecteur dans le four principal et pénètre dans la colonne

Matériel et méthodes

40 chromatographique. La colonne est l'élément séparateur dont la paroi intérieure est recouverte d'une mince couche séparatrice. En passant dans la colonne, les constituants de l'échantillon interagissent avec cette couche : en fonction des affinités chimiques qu'ils ont avec elle, ils sont retenus plus ou moins longtemps dans la colonne. Une analyse est bien menée lorsque les molécules introduites ensemble sortent successivement de la colonne. La détection d'un type de molécules en sortie de colonne produit un pic sur le chromatogramme. Le chromatogramme est un diagramme qui présente sur l'axe horizontal le temps passé dans la colonne (temps de rétention) en fonction de l'intensité du signal sur l'axe vertical.

Les paramètres de la méthode sont résumés comme suit :

Injecteur : Speed, T° = 250° C- Volume injecté :

Colonne Capillaire CP-Select CB, type WCOT Fused Silica de longueur 50m, de diamètre intérieur

0,25mm, de diamètre extérieur 0,39mm et de film 0,25mm

Pression du gaz vecteur (He) : 130Kpa

Détecteur : FID, T = 250° C 3°C/ mn 6°C/mn

Programme de température : 140° C ---200° C---240° C - Temps : 26 minutes.

En effet, les chromatogrammes ainsi obtenus sont formés ensemble de pics correspondant aux esters méthyliques de différents acides gras présents dans les échantillons Le pourcentage de chaque acide gras est donné par la formule suivante:

S: Surface du pic correspondant à gras considéré.

S: Somme des surfaces de touts les pics du chromatogramme et qui correspond à la totalité des acides gras.

Matériel et méthodes

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VIII.2. Analyse des triacylglycérols

a. Préparation de contenant les fractions triacylglycérols totales

0.3 ± 0.001 g chantillon d sont dissous dans 10 ml du mélange (2-propanol/acétonitrile/n-hexane (2:2:1; v/v)). Tous les solvants sont filtrés avant leur utilisation à

travers un filtre disque (Lida) dont les pores ont 0.45 µm de diamètre. b. Séparation des espèces moléculaires des triacylglycérols par HPLC

La séparation des espèces moléculaires formant les triacylglycérols (TAG) est réalisée par HPLC (chromatographie liquide à haute performance). C'est une chromatographie de partage entre une phase stationnaire solide et une phase mobile liquide. La chromatographie liquide permet de séparer les différentes espèces de TAG selon leur longueur de chaîne carbonée (en fonction du nombre de carbone formant les trois chaînes d'acides gras) et selon leur degré d'insaturation. Les triacylglycérols sont fractionnés dans un chromatographe HPLC, modèle HP 1100 Series instrument (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) équipé pompe binaire, un dégazeur et un système automatique (autosampler). Dans nos analyses, nous avons utilisé une colonne Luna C18 (Phenomenex, Torrance, CA, USA), 5 diamètre des particules, 25 cm × 3.00 mm diamètre intérieur couplée à une précolonne C18 filtre (Phenomenex) à température ambiante. Le volume injection est de 10 Dans la phase éluante, le 2-propanol est utilisé comme étant la phase mobile A et

acétonitrile comme étant la phase mobile B.

a un débit de 0.7 ml/mn selon le gradient linéaire suivant : de 0 à 2 min 52% B, 4 min 58% B, 25 min 58% B, 30min 10% B, 37 min 52% B. des pics des triacylglycérols est réalisée par comparaison avec les chromatogrammes décrits dans la littérature (Perrin et Prevot, 1986) et plusieurs standards internes : PPO, SOO qui sont obtenus de Matreya (Pleasant Gap, PA, USA) et OOL, POO, OOO qui sont obtenus de Sigma Chemicals Co (St. Louis, MO, USA). HPLC est couplé à un DDLE [détecteur par diffusion de la lumière avec évaporation : evaporative light scattering detector (ELSD)] modèle PL ELS 1000 Series (Polymer laboratories, Varian Inc., Amherst, MA, USA). Ce détecteur est maintenu dans les conditions suivantes : température de : 70 °C ; température du nébuliseur : 30°C ; ligne de transfert : 30 et flux de gaz : 1.0 l/min.

Matériel et méthodes

42 c. Intérêt de la détection par diffusion de la lumière avec évaporation (DDLE)

Le détecteur par diffusion de la lumière avec évaporation est un détecteur universel couramment utilisé en chromatographie liquide. un détecteur à haute sensibilité et versabilité permettant de détecter des solutés, même partiellement volatils, grâce à à basse température de la phase mobile. De plus, les cellules optiques de détection permettent des limites de détection de du nanogramme.

Les trois points essentiels de la technologie du DDLE sont :

1- La nébulisation de l'éluant et la sélection des gouttelettes afin de minimiser le bruit de fond = production d'un aérosol (fines gouttelettes),

2- L du solvant à basse température,

3- La détection : mesure de l'intensité du signal de lumière diffusée par les microparticules liquides ou solides.

Avec son système innovant à basse température breveté, les détecteurs DDLE permettent l'évaporation de la phase mobile à basse température, grâce à une parfaite maîtrise de la sélection des gouttelettes après la nébulisation et la protection de l'échantillon pour détecter tous les composés du mélange, y compris les semi-volatils et les thermolabiles. Cette étape cruciale est visible en continu du fait de la présence du nébulisateur en façade. Cet appareillage permet l'utilisation d'un gradient d'élution, tout en conservant la stabilité de ligne de base, ce qui permet d'améliorer les séparations et de diminuer les temps d'analyse (Carelli et al., 1993 ; Macher et al., 2001 ).