Cadre et Objectifs du travail concernant le développement de vaccins recombinants à base de vecteurs viraux de type poxvirus
4.3.4. Etude de faisabilité d’un vaccin capripoxvirus recombinant contre la FCO protégeant contre plusieurs sérotypes
4.3.4.1 Le virus de la FCO
L’agent responsable de la FCO est un virus non enveloppé avec une capside à symétrie icosaédrique dont la taille varie entre 60 et 80 nm, de la famille des Reoviridae, genre
Orbivirus (Borden et al., 1971). Le génome viral, logé au sein de la capside interne, est
composé de 10 segments d’ARN double brin de tailles différentes. La taille totale du génome est d’environ 19200 bases. Le tableau 3 présente les caractéristiques des segments génomiques du virus de la FCO ainsi que leur produits d’expression. Les protéines peuvent être classées en deux catégories, les protéines structurales (VP1 à VP7) et les protéines non structurales (NS1 à NS3) (Verwoerd, 1969). Une représentation schématique de la structure du virus de la FCO est donnée en Figure 11. La protéine VP2, constituant majeur de la capside externe, est la protéine la moins conservée de toutes les protéines (Mertens et al., 1987; Roy et al., 1989) et est l’antigène spécifique de type (Cowley & Gorman, 1989; Huismans & Van Disjk, 1990; Mertens et al., 1987; 1989; Roy et al., 1989). La capside interne (ou core) est composée de deux protéines structurales majeures, VP7 et VP3 et de trois protéines structurales mineures, VP1, VP4 et VP6 (Howell, 1960; Huismans, 1987; Huismans & Van Disjk, 1990; Mertens, 1987). La protéine VP7 est le composant majeur de la capside
interne du virus et possède également des déterminants antigéniques de groupe (Huismans & Van Disjk, 1990; Roy et al., 1989; Gumm & Newman, 1982). La matrice (ou subcore) est composée par la protéine VP3, qui interagit de manière forte avec les trois protéines mineures VP1, VP4 et VP6 (Gouet et al., 1999; Grimes et al., 1998); ces trois dernières constituant le complexe de transcription (Albina et al., 2007). La protéine VP3 est une protéine qui possède des déterminants antigéniques spécifiques du groupe (Roy, 1992; Iwata et al., 1992).
Tableau 3 - Caractéristiques des segments génomiques du virus de la FCO
Adapté de 1 Roy, 1992, 2 1989; 3 Huisman & Vandisjk, 1990; 4 Pedley et al., 1988; 5 Hewat et al., 1992a; 6 Huismans & Vandisjk, 1990; 7
Mertens et al., 1984; 8 Mertens et al., 1987; 9 Roy et al., 1988; 10 Urakawa et al., 1989; 11 Cowley & Gorman, 1989; 12 Mertens et al., 1989; 13
Roy et al ., 1989; 14 Huisman et al., 1987; 15 Gouet et al., 1999; 16 Grimes et al.,1998; 17 Le Blois et al., 1992; 18 Hewat et al., 1992b; 19
Huisman & Els, 1979; 20 Mertens et al., 1996; 21 Xu et al., 1997; 22 Gumm & Newman, 1982; 23 Brookes et al., 1993; 24 Thomas et al., 1990;
25 Kar et al., 2007; 26 Theron et al., 1994; 27 Roy et al., 1990a; 28 Stauber et al., 1997; 29 Wu et al., 1992; 30 Bansal et al., 1998; 31 Hyatt et al.,
1993.
Figure 11 - Représentation schématique de la structure du virus de la FCO
4.3.4.2 Evaluation de l’immunogénicité et de la protection du vaccin capripox recombinant contre la FCO
Les travaux présentés dans ce sous-chapitre correspondent à ceux réalisés lors de la thèse d’Aurélie Perrin que j’ai encadrée. En ce qui concerne notre vaccin, le choix des gènes exprimés s’est porté en priorité sur les gènes les mieux conservés entre sérotypes, ceux codant pour les protéines non structurales, NS1, NS2, NS3 et le gène codant pour la protéine constitutive de la capside interne, VP7. Le gène codant pour la protéine de la capside externe, VP2, épitope neutralisant majeur, a été choisi également afin de valider notre système vaccinal en épreuve homologue. Les vecteurs de type capripoxvirus induisent préférentiellement une réponse de type cellulaire contre le transgène, susceptibles de conférer
Segments (taillle en pb) Protéines Masse molaire
(Da)1, 2 Localisation5,6,7,8 Nombre de molécules
par virion3, 4 Propriétés
1 (3954) VP1 149 588 Protéine mineure de la
capside interne 11
Antigène de groupe ARN polymerase ARN dépendante9, 10
2 (2926) VP2 111 112 Protéine majeure de la
capside externe 180
Spécificité de type6, 8, 11, 12, 13
Antigène protecteur14
Ligand récepteur cellulaire8, 14
Protéine la plus variable 8, 13
3 (2770) VP3 103 344 Protéine majeure de la
capside interne 120
Antigène de groupe Contrôle la taille et l'organisation de la structure de la capside15, 16
Interagit avec les protéines mineures du subcore15, 16
4 (1981) VP4 76 433 Protéine mineure de la
capside interne 9 Guanylyltransferase
17
7 (1156) VP7 38 548 Protéine majeure de la
capside interne 780
Intervient dans l'entrée dans la cellule20, 21
Antigène de groupe3, 13, 22
9 (1046) VP6 35 750 Protéine mineure de la capside interne 67
Antigène de groupe Fixe les ARN sb et db26
Hélicase27
5 (1769) NS1 64 445
6 (1638) VP5 59 163 Spécificité de groupe8,11, 12
Forme des tubulesdans le cytoplasme des cellules18, 19 Protéine non structurale 0
Protéine non structurale Protéine majeure de la
capside externe 292
0 Associée aux corps d'inclusion
23, 24
Fixe les ARN messagers25
10 (822) NS3/NS3A 25572 / 24020 Protéines non structurales 0 Glycoprotéine
28, 29
Libération des virions30,31
8 (1124) NS2 40 999
Membrane externe 2 protéines majeures VP2, VP5
Nucléocapside ou core
2 protéines majeures et 3 protéines mineures
VP7
VP1, VP3, VP4, VP6
(Subcore ou matrice)
une immunité protectrice contre tous les sérotypes du virus lorsqu’elle est dirigée contre des antigènes conservés.
Dans la littérature, il a été montré que les lymphocytes T cytotoxiques (LTC) jouent un rôle important chez le mouton dans la protection contre le virus de la FCO avec un pic maximal 14 jours après infection (Jeggo et al., 1985). Ils reconnaissent fortement les protéines NS1 et un peu moins les protéines VP2, VP3, VP5 et VP7 (Janardhana et al., 1999). L’objectif de ce projet était de générer des LTC mémoires contre des antigènes conservés pour protéger l’espèce animale concernée contre un maximum de sérotypes. L’expression de différentes protéines du virus de la FCO via un vecteur de type poxvirus permet de générer des réponses immunes protectrices, ainsi un capripoxvirus recombinant VP7 a déjà apporté une protection contre le sérotype homologue et une protection partielle contre un sérotype hétérologue (Wade-Evans et al., 1996). Lobato et al., 1997 et Boone et al., 2007 ont également démontré la capacité de vecteurs recombinants de type vaccine et canarypoxvirus respectivement exprimant les protéines de la capside externe, VP2 et VP5 de la FCO, à générer une protection contre le sérotype homologue. Par ailleurs les protéines NS2 et NS1 ont été montré comme étant capables de générer des LTC chez la souris (Jones et al., 1997) et chez le mouton (Andrew et al., 1995) respectivement.
Notre objectif était donc d’évaluer la capacité de notre vecteur de type capripoxvirus, recombinant pour quatre protéines différentes du virus de la FCO, à améliorer ce type de réponse par l’induction d’une protection chez les petits ruminants contre plusieurs sérotypes et la stimulation d’une réponse immunitaire spécifique.
Les différentes étapes de construction de nos recombinants capripoxviraux protégeant contre la FCO
1-Construction du plasmide de transfert utilisé lors de la recombinaison homologue lors de
l’étape de transfection avec le capripoxvirus pour chacun des 4 gènes (VP2, VP7, NS1 et NS3)
Le choix du site d’insertion dans le génome du capripoxvirus pour ces recombinants s’est porté sur le gène de la TK (Dubbs et al., 1964, Wallace and Viljoen, 2005). Ainsi le plasmide comporte les parties flanquantes TKg et TKd présentes dans le génome du capripoxvirus, éléments clefs permettant la recombinaison, le gène de sélection Ecogpt et les gènes clonés dans le site de clonage comme présenté dans la Figure 12 (Boyle et al., 1985). Chaque gène d’intérêt a été cloné individuellement dans le site de clonage multiple du plasmide de transfert.
Figure 12 : Carte de restriction du plasmide Figure 13 : Etape de recombinaison navette portant le gène VP7 du sérotype 2 homologue
2-Vérification de la fonctionnalité du plasmide par expression transitoire
La figure 14 présente le témoin négatif (a) et le témoin positif (b) correspondant respectivement aux cellules OA3Ts non infectées et aux cellules transfectées avec un plasmide exprimant la «green fluorescent protein». Ces contrôles ont suivi le même protocole de fixation et de marquage que les échantillons. La figure 14 (c) présente le niveau d’expression du plasmide de transfert exprimant le gène de la VP7, pKSCATpSGPT-VP7.
Figure 14 - Détection par immunofluorescence de l’expression des protéines VP7 dans des cellules OA3Ts transfectées avec le plasmide pKSCATpSGPT-VP7- Microscope optique à fluorescence x10
a- témoin négatif cellules, b- témoin positif pEGFP, c- pKSCATpSGPT-VP7 après 48h d’incubation
3-Transfection et Purification
L’étape de transfection ou recombinaison homologue (Figure 14) s’est faite sur des cellules OA3Ts en présence de la souche virale KS-1 (Kenya Sheep) (MOI de 0.1), d’une quantité donnée de plasmides de transfert, d’ADN du virus KS1 et de Lipofectamine 2000 comme décrit par Romero et al., 1993. La sélection des virus recombinants et leur purification s’est faite avec le même marqueur de sélection négatif ecogpt.
4-Evaluation de l’immunogénicité et de la protection des constructions VP2, VP7, NS1, NS3 L’évaluation de l’immunogénicité et de l’effet protecteur de ces constructions s’est faite par des expérimentations animales avec les virus recombinants purifiés et 2 modèles d’espèces : les caprins et les ovins. Une première expérience chez les chèvres a permis de tester l’immunogénicité des constructions (analyse de la réponse immunitaire de type humorale et de type celullaire). Une seconde, chez les moutons, a permis de reproduire les résultats obtenus chez les chèvres et d’évaluer l’effet protecteur des réponses induites par la présence/absence de signes cliniques après épreuve virulente (sérotype 2-FCO).
Ci-dessous, le protocole d’administration employé :
Figure 15 : Représentation schématique du calendrier expérimental des essais capripoxvirus recombinants.
- Analyse de la réponse immunitaire
Les réponses immunitaires ont été suivies pour tous les gènes par ELISA (VP7, NS1, NS3) ou séroneutralisation (VP2). A titre d’exemples, la Figure 16 présente les réponses anti-NS3 et anti-VP7 respectivement, chez les chèvres (a) et chez les moutons (b). Il a pu être noté une augmentation significative des anticorps à la 4ème semaine suivant l’inoculation avec un boost à J35 chez les animaux du groupe Cpox-FCO comparativement aux animaux de groupe témoin.
Immunisations
Groupe témoin = vaccin irrelevant Groupe CPox-FCO = mélange virus recombinants Cpox-FCO
2x106TCID50 (SC)
J21
Épreuve homologue
sérotype 2 souche atténuée ou virulente
104TCID50 (SC)
J28 J35
Tube sec- Sérum Tube EDTA- PCR Tube Héparine-PBMC J7 J14 J42 J49 J56 E u th an asi e p o u r l’ ép reu ve vir ule nte
Temperature + signes cliniques
Figure 16 - Réponse anti-NS3 et VP7 obtenue au cours des essais capripoxvirus recombinants. a. Expérimentation chèvres, b. expérimentation moutons
Une séroconversion contre les antigènes NS3 et VP7 est observé à la fois chez les chèvres et chez les moutons avant épreuve, atténuée (chèvres) ou virulente (moutons). Une séroconversion dirigée contre les antigènes VP2 est également observée chez les moutons, une semaine avant épreuve. De plus, on observe un effet rappel, dû à l’épreuve, à J35, chez tous les animaux des groupes Cpox-FCO. Les animaux développent également des anticorps anti-capripoxvirus (groupes témoins et groupes Cpox-FCO). Ceci démontre la capacité de nos vaccins capripoxvirus exprimant différents gènes du virus de la FCO à générer des anticorps à la fois contre le vecteur mais aussi contre les transgènes. L’activation et la prolifération spécifiques des PBMCs caprins après restimulation avec les antigènes FCO et KS-1 entiers, inactivés, confirme l’immunogénicité des capripoxvirus recombinants FCO délivrés aux animaux (Perrin et al., 2007).
- Evaluation de la protection
L’effet protecteur de nos vaccins capripoxvirus-FCO a été évalué chez les moutons après épreuve virulente. Seule, une protection partielle a été obtenue ; en effet certains animaux ayant reçu les constructions vaccinales capripoxvirus-FCO ont développé des sines cliniques et un animal est mort au cours de l’expérimentation.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 a.
ELISA NS3 – sérums caprins
J0 J14 J21 J28 J35 J42 J49 De n sité s op tiq u e s Jours post-immunisation b. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 J0 J14 J21 J28 J35 De n sité s op tiq u e s Jours post-immunisation ELISA NS3 – sérums ovins
b. De n sité s op tiq u e s Jours post-immunisation 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 J 0 J 7 J 14 J 21 J 28 J 35 a.
ELISA VP7 – sérums caprins
b. D ens it és o ptiques Jours post-immunisation 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 J0 J21 J28 J35
ELISA VP7 – sérums ovins
Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin Groupe Cpox-FCO Groupe Témoin
Figure 17 - Scores cliniques obtenus chez les moutons au cours des essais capripoxvirus recombinants
La figure 17 présente les scores cliniques attribués à chaque animal correspondant à la totalité des points obtenus, incluant la mortalité, au cours de l’expérimentation ramené au nombre de jours de clinique. Il apparaît une différence entre les deux groupes confortée par le test statistique de Kruskal-Wallis (p<0.005). En effet, 2 animaux sur 11 du groupe Cpox-FCO ne présentent aucun signe clinique et 4 autres présentent des scores inférieurs à 3 points. En revanche, les animaux du groupe témoin ont des scores, pour la majorité (6/10) supérieurs à 5 points.
Les résultats présentés dans le sous-chapitre 4.3.4 ont fait l’objet de la publication suivante :
Perrin A., Albina E., Breard E., Sailleau C., Prome S., Grillet C., Kwiatek O., Russo P., Thiery R., Zientara S., Cêtre-Sossah C. Recombinant capripoxviruses expressing proteins of bluetongue virus: Evaluation of immune responses and protection in small ruminants. Vaccine. 2007. 25(37-38):6774-83.
4.3.4.3. Conclusion
En conclusion de ce travail de thèse très largement initié et réalisé par Aurélie Perrin (thèse soutenue en Novembre 2007), et devant l’obtention d’une protection partielle de ces recombinants-FCO, de nouveaux essais ont été initiés avec une stratégie nouvelle consistant à co-exprimer les deux protéines de la capside interne du virus de la FCO, VP3 et VP7. Ils seront détaillés dans le paragraphe 4.4 de ce manuscrit correspondant aux perspectives.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 Animaux Sco res cl ini ques Groupe témoin Groupe Cpox-FCO
4.3.5 Contribution au développement d’un vaccin capripoxvirus recombinant