Développement de tests moléculaires permettant la détection de l’espèce Culicoides

imicola, vecteur confirmé de la fièvre catarrhale ovine (FCO) en Corse et des espèces du

groupe Obsoletus vectrices de la FCO sur le continent Français

4.2.4.1 Détection de C. imicola

Je me suis intéressée d’abord au développement d’une technique PCR basée sur les marqueurs ITS-1 (Internal Transcribed Spacer), de l’ADN ribosomal permettant la détection du vecteur d’intérêt en 2004 Culicoides imicola, vecteur pouvant être présent dans les pièges, et être la source d’une introduction de FCO en Europe par la voie Sud-Est (Corse vers la vallée de l’Argens (83)). Ce vecteur est en effet puisque présent en Corse depuis 2000 ainsi que sur la côte Sud-Est méditéranéenne Française (Roquebrune sur Argens (83) depuis 2003. Pour cela, j’ai mis au point une PCR conventionnelle à partir de différentes espèces de Culicoides. Le choix des amorces s’est fait à partir de l’alignement de 11 séquences d’ITS-1 d’espèces connues de Culicoides. Les résultats obtenus présentent une très bonne spécificité, avec l’amplification d’un fragment de 303 bp spécifique de C. imicola (Figure 5) (Cêtre-Sossah et

Cette première PCR conventionnelle qualitative permettant la détection de C. imicola de façon spécifique m’a permis de développer une PCR en temps réel permettant la quantification de spécimens de C. imicola présents dans un piège dans le cadre du réseau de surveillance entomologique français (Cêtre-Sossah et al., 2008). Ainsi, des courbes standard ont été établies avec un très bon coefficient de corrélation de r²=0.99 à partir de plasmides contenant les ITS-1 de C. imicola. Un total de 100 pièges répartis sur le littoral méditéranéen ont été testés négatifs pour la présence de C. imicola. Sur 40 de ces pièges choisis au hasard en double aveugle, soit 1 spécimen de C. imicola (dans les 20 pièges) soit 5 spécimens (dans les 20 autres pièges) ont été ajoutés. Sur chacun de ces 100 pièges, la PCR a été réalisée, et un certain nombre de valeurs de Ct ont été obtenues et sont présentées Figure 6. Il apparait qu’en fixant un seuil de Ct de valeur de 30.5, la sensibilité de notre technique est de 95% et la spécificité de 92% (Figure 7). 0 5 10 15 20 25 21 23 25 27 28 29 30 31 33 35 37 39 41 Ct value intervals Fre qu e nc y

Figure 6 : Distribution des valeurs de Ct obtenues à partir de 100 pièges à UVs en France continentale en 2004 (pays indemne).

Figure 7 : Courbe ROC obtenue avec les valeurs de Ct de PCR temps réel et la morphologie (considéré comme gold standard).

Conclusion : Cette technique de PCR temps réel est donc d’une grande utilité dans les réseaux d’entomosurveillance européens et demande à être étendue à d’autres espèces de

Culicoides compétents et présents en Europe du Nord (espèces du groupe Obsoletus) puisque

robuste et avec une très bonne sensibilité et spécificité.

4.2.4.2 Détection des espèces du groupe Obsoletus

Comme il a déjà été décrit précédemment, l’identification est réalisée en fonction de ressemblances morphologiques sur la base d’une clé d’identification (Delécolle, 1985) et notamment grâce aux motifs alaires composés de zones claires et de zones sombres. Cependant, un certain nombre d’espèces notamment les 5 espèces composant le groupe Obsoletus : C. chiopterus, C. dewulfi, C. montanus, C. obsoletus, C. scoticus sont difficilement différenciables. La mise au point d’une PCR multiplexe trouve donc tout son intérêt pour l’identification de Culicoides adultes mais également pour les larves qui, elles aussi, sont difficiles à différencier. Cinq couples d’amorces ont été dessinés afin de permettre la détection de chacune de ces espèces par une PCR multiplexe (Mathieu et al., 2007). Le profil présenté en Figure 8 a été obtenu, avec la présence d’une bande commune à 166 bp pour toutes les espèces, ensuite une bande additionnelle à 78 bp, 117 bp et 302 bp est présente respectivement pour C. dewulfi, C. chiopterus et C. obsoletus.

Figure 8 : Gel d’agarose présentant les amplicons de la PCR multiplexe Obsoletus groupe – (1 : C. chiopterus, 2 : C. dewulfi, 3 : C. montanus, 4 : C. obsoletus ss, 5 : C. scoticus

ss)-0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Sensitivity 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1 - Specificity Area under ROC curve = 0.9752

Conclusion et Perspectives :

Les résultats obtenus avec la PCR multiplexe pour les espèces du groupe Obsoletus sont très encourageants et ont permis d’initier le développement d’une PCR en temps réel de type TaqMan avec plusieurs sondes spécifiques de chacune des espèces à détecter. Ce travail est en cours et fait partie intégrante du travail de la thèse de Bruno Mathieu.

Les résultats présentés dans le sous-chapitre 4.2 ont fait l’objet des publications suivantes :

Cêtre-Sossah C., T. Baldet, JC. Delécolle, B. Mathieu, A. Perrin, C.Grillet and E. Albina. Molecular detection of Culicoides spp. and Culicoides imicola, the principal vector of bluetongue (BT) and African horse sickness (AHS) in Africa and Europe. Vet Research. 2004. 35 :325-337.

Perrin A., Cêtre-Sossah C., T. Baldet, JC. Delécolle, B. Mathieu, E. Albina^.. Phylogenetic analysis of Culicoides species from France based on nuclear ITS1-rDNA sequences. Med. Vet. Entomol. 2006. 20(2):219-28.

Mathieu B., A. Perrin, T. Baldet, JC. Delécolle, , E. Albina and Cêtre-Sossah C. Molecular identification of the Obsoletus complex species larvae (Diptera: Ceratopogonidae) by an ITS-1r DNA multiplex PCR assay: new approach of vector ecology in bluetongue. Journal of Medical Entomology.2007. 44 (6):1019-1025.

Cêtre-Sossah C., Mathieu B., Setier-Rio M.L., Grillet C., Baldet T., Delécolle J.C., Albina E. Development and

evaluation of a real-time quantitative PCR assay for Culicoides imicola, one of the main vectors of bluetongue (BT) and African horse sickness (AHS) in Africa and Europe. Res Vet Sci. 2008. 85(2):372-82.

Sur la thématique de la détection moléculaire des Culicoides, deux stages de DEA ont été validés (Aurélie Perrin en 2004 et Bruno Mathieu en 2005) et une thèse est en cours actuellement, celle de Bruno Mathieu.

Ces travaux relatifs à la détection moléculaire des insectes vecteurs de la FCO m’ont permis d’appréhender le milieu de la recherche en santé animale et le terrain qui lui est associé et d’approfondir mes connaissances en biologie moléculaire. Ces connaissances me sont très utiles pour mener à bien une autre thématique sur laquelle je travaille: l’élaboration de vaccins recombinants grâce à des vecteurs de type capripoxvirus. Après une rapide bibliographie des poxviroses (Paragraphes 4.3.1 et 4.3.2), les objectifs de mon travail seront présentés suivis des premiers résultats générés pour les vaccins recombinants pour la FCO (Paragraphe 4.3.4) et ceux pour la FVR (Fièvre de la Vallée du Rift) et la PPR (Peste des Petits Ruminants) (Paragraphe 4.3.5).