Etude de l’effet des mutations ADB sur l’interaction de RPS19 avec l’ARN poly-U

qui sont effectuées avec la tige-boucle 1537-1598, indiquant une meilleure affinité de

RPS19 pour l’ARN poly-U (Figure II-4, pistes 7-10). Dans la suite de ce travail, nous

avons donc choisi d’utiliser l’ARN poly-U comme substrat d’interaction.

2. Etude de l’effet des mutations ADB sur l’interaction de RPS19 avec l’ARN poly-U

Nous avons vu qu’in vitro, RPS19 sauvage et la tige boucle 1537-1598 du domaine

majeur 3’ de l’ARNr 18S ne reconstituent pas efficacement le complexe RPS19-ARN,

ce qui ne permet pas de poursuivre le test d’interaction avec les formes mutées. Par

contre, il y a bien eu formation de complexe RPS19-ARN poly-U. Afin de mieux

analyser l’interaction de l’ARN avec les formes sauvage et mutées de RPS19, nous

avons utilisé de l’ARN poly-U marqué au 32P à la place de la tige boucle 1537-1598 du

A B C D E Rps19p-ARN Poly-U Rps19p-ARN Poly-U ARN Poly-U ARN Poly-U ARN Poly-U Rps19p-ARN Poly-U 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 _{1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11} 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 Rps19p ( ug) 1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0 Rps19p ( ug) 1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0 1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0 Rps19p ( ug) _{1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0.33 0.11 1 0} 1 0.33 0.11 0.03 1 0.33 0.11 0.03 1 0

Figure II-5. Les mutations DBA n'altèrent pas la liaison de RPS19 à l'ARN poly-U.

Des concentrations décroissantes ( 1, 0.33 et 0.11 ug ) de protéine Rps19 ont été utilisées pour tester l'interaction avec 2.5 fmol d'ARN poly-U en présence de 1.6 pmol d'ARN poly-A utilisé comme compétiteur. Les mutants R56Q (A), R62Q (B) et Q106E (D) montrent une affinité pour l'ARN poly-U qui peut être estimée équivalente à celle montrée par RPS19 sauvage. Par contre, les mutations R101H (B), K115E (C), R133E (D) et R121E (E) montrent une affinité qui apparaît plus forte pour l'ARN poly-U comparée à celle du sauvage. Le mutant S59F (A) intera- git également avec l'ARN poly-U même si il montre deux complexes superposés de taille différente.

WT R56Q S59F BSA WT R62Q R101H BSA

BSA

BSA BSA

utilisé pour analyser l’interaction d’une protéine avec l’ARN lorsque aucune séquence

spécifique n’est connue.

Plusieurs formes mutées de RPS19 humaine ont été produites chez E. coli par le

laboratoire de Sébastien Fribourg (Figure II-2,A). Les mutations portaient sur des

résidus à la surface de l’hélice 3 formant le sillon central (patch basique 1 : S59F,

R56Q, R62Q) et des acides aminés du deuxième domaine basique (R101H, Q105E,

K115E, K121E). Une autre mutation concerne la lysine 133 (K133E) dans l’hélice C-

terminale. Nous avons analysé l’interaction de ces protéines avec 2.5 fmol d’ARN poly-

U en présence de 1.6 pmol d’ARN poly-A utilisé comme agent compétiteur des

interactions de faible affinité (Figure II-5).

L’expérience nous a montré qu’in vitro, des complexes RPS19-ARN se constituent

entre les formes sauvage et mutées de RPS19 et l’ARN poly-U. Contrairement à l’effet

attendu, aucune des mutations étudiées ici n’altère l’interaction de RPS19 avec l’ARN

(Figure II-5). Les mutants présentent une affinité pour l’ARN équivalente, voire

supérieure à celle de la forme sauvage dans la mesure où des complexes sont observés

pour de plus faibles quantités de protéine. En effet, les formes portant les mutations

R56Q (Figure II-5,A, pistes 4-6), R62Q (Figure II-5,B, pistes 4-6) et Q106E (Figure II-

5,D, pistes 4-6) montrent la même affinité pour l’ARN poly-U que la forme sauvage.

Par ailleurs, d’autres mutations semblent entrainer une plus grande affinité pour l’ARN

poly-U: c’est le cas des mutations S59F (Figure II-5,A, pistes 7-9), R121E (Figure II-

5,E, pistes 5-8), R101H (Figure II-5,B, pistes 7-9), K115E (Figure II-5,C, pistes 4-6) et

R133E (Figure II-5,D, pistes 7-9). La mutation S59F (Figure II-5,A, pistes 7-9)

constitue un cas particulier avec l’observation de deux complexes de taille relativement

différente. Ces données indiquent que les mutations ADB n’altèrent pas la capacité de

3. Conclusion

Dans ce travail, nous avons effectué une étude in vitro des interactions RPS19-ARN

avec des protéines recombinantes purifiées chez E. coli afin d’analyser l’effet des

mutations ADB sur cette activité. Dans ces conditions, nous avons montré l’existence

d’une interaction RPS19-ARN même si une conclusion sur l’effet qu’auraient les

différentes mutations n’a pu être rapportée.

En effet, la formation d’un complexe entre RPS19 et l’ARN poly-U confirme que la

protéine est capable de se lier à l’ARN. En revanche, le site potentiel de liaison proposé

par Buchhaupt et al. (2006) ne s’est pas révélé être un bon substrat in vitro. Outre la

nature hypothétique de ce domaine d’interaction, on peut noter qu’il ne présente pas de

segment d’uracyles répétées. Nos résultats n’excluent pas formellement que cette tige

boucle soit le site de liaison in vivo. L’intervention de chaperones, ou la nécessité d’une

structure particulière de l’ARN non reproduite in vitro, pourrait permettre une

interaction de plus forte affinité.

Les expériences chez la levure S. cerevisiae montrent que les mutations ADB

empêchent l’incorporation de Rps19p dans les particules pré-40S. Les résultats

d’interaction in vitro avec l’ARN ne mettent pas en évidence un impact direct des

mutations sur la liaison de RPS19 avec un ARN poly U.

En effet, les mutations R56Q et R62Q localisées dans le hot spot des mutations DBA

ainsi que la mutation R101H du patch basique B altèrent la croissance cellulaire chez S.

cerevisiae. D’après la structure de RPS19, ces résidus sont exposés au solvant et seraient potentiellement impliqués dans les interactions de la protéine avec l’ARN. Il a

été également montré que ces mutations affectent l’incorporation de la protéine dans les

l’interaction avec l’ARN. De manière surprenante, les complexes formés après

l’interaction indiquent une affinité supérieure ou égale de ces dernières pour l’ARN

poly U comparativement à la forme non mutée.

In vivo, le complexe Rps19p-ARNr 18S fait partie d’un ensemble macromoléculaire plus complexe. Dans ces conditions, la protéine Rps19p pourrait adopter une

conformation particulière pour interagir avec l’ARNr grâce à des partenaires protéiques

qui la structurent dans le ribosome. Par ailleurs, nous savons que la fonction de l’ARNr

18S est étroitement liée à son organisation générale. Dans ce cas, l’absence de tout

facteur peut avoir des conséquences sur l’interaction de la protéine avec l’ARNr.

L’interaction Rps19p-ARN peut être inhibée soit en destabilisant la structure de

l’ARNr, soit en empêchant son interaction avec des facteurs. Or, ces conditions ne sont

pas assurées in vitro, ce qui complique l’analyse.

La structure complète de l’ARNr 18S doit lui conférer une flexibilité suffisante pour

s’adapter à la structure des protéines ribosomiques et ainsi effectuer une interaction

correcte. In vitro, la séquence 1537-1598 qui code pour une boucle de l’ARNr 18S

pourrait ne pas suffire pour effectuer cette interaction. Ceci peut expliquer pourquoi

nous avons obtenu un complexe quelque soit la mutation analysée.

Par ces expériences, nous avons montré qu’il existe une affinité de la protéine RPS19

pour l’ARN, in vitro. En revanche, il n’a pas été possible pour nous de conclure quant à