Construction plasmidique

Les différents plasmides utilisés dans cette étude sont décrits aux tableaux 5-10. Tout

d’abord, la séquence correspondant au gène (ou le fragment de gène) à cloner est

amplifiée par PCR grâce à des oligonucléotides sens et antisens contenant soit des sites

extrémités. Ce produit de PCR est ensuite purifié et quantifié en vue de son clonage

dans un vecteur soit par restriction enzymatique, soit par recombinaison homologue.

6.1. Mutagenèse dirigée

Les différentes mutations ont été introduites dans les oligonucléotides ayant servi à

amplifier par PCR la séquence contenant une mutation quelconque dans le gène RPS19.

Cette séquence est ensuite clonée dans le vecteur plasmidique par recombinaison

homologue chez la levure S. cerevisiae.

6.1.1. OLIGONUCLEOTIDES UTILISES

La mutagenèse dirigée fait intervenir deux couples d’oligonucléotides. On utilise le

couple 1 d’oligonucléotides complémentaires contenant la mutation désirée et possédant

une séquence de 15 nucléotides des deux côtés de la mutation. Le couple 2

d’oligonucléotides qui flanque la séquence à cloner est conçu de manière à permettre

son clonage par recombinaison homologue dans le vecteur choisi. Des séquences d’une

longueur de 27 nucléotides sont utilisées pour la recombinaison homologue chez S.

cerevisiae. On effectue une première série de 2 PCR où on utilise les couples oligonucléotide sens 1/ oligonucléotide non sens 2 et oligonucléotide sens 2/

oligonucléotide non sens 1. Les deux produits issus de cette première série de PCR sont

purifiés sur gel et mélangés en quantités équimolaires pour être utilisé comme matrice

dans la deuxième série de PCR utilisant les oligonucléotides du couple 2. C’est ce

produit de PCR qui est utilisé pour le clonage par recombinaison homologue chez S.

6.1.2. REACTION

Les mutations sur RPS19 ont été effectuées à partir d’un programme classique de PCR

utilisant le gène RPS19 comme matrice. Pour cela, on effectue une première série de

PCR où on utilise deux couples d’oligonucléotides différents. Le premier couple

comprend l’oligonucléotide sens contenant la mutation et l’oligonucléotide de

l’extremité 3’ du gène RPS19 et contenant la séquence de recombinaison avec le

vecteur, tandis que le second couple comprend l’oligonucléotide antisens contenant la

mutation et l’oligonucléotide de l’extremité 5’ du gène RPS19 et contenant la séquence

de recombinaison avec le vecteur. Les deux produits de PCR sont purifiés sur colonne

GFX après distinction des fragments sur gel d’agarose. Une quantité équimolaire des

deux produits de PCR est ensuite utilisée comme matrice pour amplifier le gène RPS19

contenant la mutation en présence des oligonucléotides en amont et en aval du gène

RPS19 et contenant les séquences de recombinaison dans le vecteur de clonage. Finalement, le produit issu de cette dernière PCR est utilisé pour la transformation de la

levure S. cerevisiae suivant le protocole de co-transformation (voir paragraphe 4.2).

L’ADN plasmidique des colonies obtenues est isolé. Deux plasmides sont par la suite

purifiés sur colonne et envoyés au séquençage pour vérification de la mutation.

6.2. Clonage du gène RPS19 humain (hsaRPS19)

L’ADN complémentaire du gène RPS19 humain a été cloné dans le vecteur pS15-Term

par RT-PCR à partir des ARN totaux humains et grâce aux oligonucléotides Hs19-F

(sens) et Hs19-R (non sens). Le plasmide pS15-hsaRPS19 est ensuite transformé dans la

souche E. coli DH5α. La séquence du gène codant hsaRPS19 est alors soit amplifiée par

ensuite inséré dans différents vecteurs selon les expériences. Il y a eu ensuite

vérification par séquençage.

6.3. Clonage du gène RPS19 de P. abyssi (PyARPS19)

Le gène codant pour la protéine RPS19 de P. abyssi a été cloné dans le vecteur

d’expression pET15b (N-His) après amplification par PCR. Cette PCR est réalisée sur

l’ADN génomique de P. abyssi gracieusement offert par Annie Mougin (CNRS-LBME,

Toulouse) et en utilisant les oligonucléotides PyA-F (sens) et PyA-R (non sens). La

séquence de PyARPS19 a été vérifiée par séquençage après clonage.

6.4. Localisation cellulaire par observation de la GFP

Une partie importante de cette étude a été l’observation de la localisation cellulaire de

différentes protéines dont Rps19p grâce au microscope à fluorescence. Pour cela, nous

avons analysé la localisation cellulaire des protéines exprimées en fusion traductionnelle

avec la GFP (Green Fluorescent Protein) grâce au plasmide pGal-GFP (Cormack et al.,

1997). Le gène RPS19 est amplifié sans le codon stop pour permettre l’expression de la

protéine de fusion RPS19p-GFP. La construction a été séquencée pour s’assurer que la

séquence des deux protéines est en phase traductionnelle.

Ce type d’observation permet essentiellement de vérifier la localisation cellulaire des

protéines. Habituellement, les cellules en phase exponentielle de croissance à la

température désirée sont observées directement dans leur milieu de culture après

6.5. Observation de la GFP après fixation des cellules

L’observation de la fluorescence se fait souvent après fixation des cellules. Pour ce

faire, les cellules sont cultivées dans un volume de 10 ml jusqu’à la phase exponentielle

de croissance. Puis, elles sont centrifugées pour être reprises dans un volume finale de 3

ml. Les cellules sont alors fixées par ajout direct de formaldéhyde à 4% final dans le

milieu pendant 30 min à la température ambiante. On les lave à deux reprises avec du

PBS avant de les resuspendre dans 1 ml de PBS. Finalement, 5 µl de la suspension sont placées entre lame et lamelle pour être observées au microscope à fluorescence.

7. Le système du double-hybride chez la levure