Etude du transcriptome musculaire (Article 5)

Problématique : La physiopathologie des lésions musculaires iatrogènes semble être polyfactorielle comme cela a été mis en évidence précédemment par l’étude des débits sanguins locaux (prostanoïdes inflammatoires, inflammation neurogénique et calcium intracellulaire). Les méthodes récentes de criblage de l’expression des gènes peuvent permettre d’appréhender une grande partie des voies réactionnelles impliquées.

Objectifs : Décrire et de comprendre la dynamique temporelle des lésions du muscle à travers les variations d’expression des gènes lors du développement et de la régénération d’une lésion musculaire iatrogène.

Matériels et méthodes : Des lésions ont été induites chez 10 porcelets par 4 administrations IM successives de 4 mL de PG dans les muscles Longissimus dorsi, représentant 4 stades d’évolution lésionnelle : 6 h, 2, 7 et 21 jours après administration, représentant l’inflammation aigue et la régénération progressive du tissu. Le muscle non administré a été utilisé comme témoin. Le schéma expérimental d’administration aux animaux est présenté en figure 20.

Hybridation : Après broyage des muscles dans l’azote liquide avec un appareil à billes d’acier inoxydable, les ARN totaux ont été extraits. Pour chaque échantillon, un aliquot de 5 μg d’ARN total a été soumis à une transcription inverse avec incorporation de dCTα33

P pour former de l’ADN complémentaire marqué (ADNc, cibles complexes).

L’ADNc a été ensuite hybridé sur des microréseaux nylon à ADN. Les 3456 séquences présentes sur les microréseaux représentaient au moins 1908 gènes identifiés, et étaient issues de deux banques porcines normalisées d’ADNc : une banque multi-tissus pour 1056 séquences (AGENAE : Analyse des GENomes d’Animaux d’Elevage, INRA, France, http://www.toulouse.inra.fr/lgc/agena/ et/ou SIGENAE : Système d’Information du projet d’Analyse des GENome d’Animaux d’Elevage, http://sigena.jouy.inra.fr/new_site/) et une banque musculaire pour 2208 séquences (Bendixen C et al, données non publiées, The Department of Food Sciences, Danish Institute of Agricultural Sciences, Tjele, Denmark).

Figure 20 – Schéma expérimental : Répartition des sites d’injection IM dans la masse lombaire de 10 porcelets (numérotés de 1 à 10). Chaque porcelet a reçu une injection IM de 4 mL de propylène glycol 21, 7 jours, 48 et 6 heures avant l’abattage.

N°1&6 N°2&7 N°3&8 N°4&9 N°5&10

Symbole Lésion 21 jours 7 jours 48 h 6 h témoin Avant Arrière

Les microréseaux ont d’abord été hybridé avec une cible oligonuclétodique (cible vecteur) complémentaire d’une séquence d’ADN unique (celle du vecteur ayant été utilisé pour la construction des banques d’ADN). Cette séquence vecteur étant présente dans chacune des 3456 séquences sondes, cette étape a permis d’évaluer la qualité des microréseaux et éventuellement de normaliser l’ensemble des signaux obtenus avec les ADNc des échantillons expérimentaux.

Analyse des microréseaux : Après exposition des microréseaux à un écran sensible au phoshore et lecture du signal par un phoshoimageur, les images obtenues ont été analysées par un logiciel dédié aux microréseaux nylon et au marquage des cibles en radioactivité. Il s’agissait d’adapter une grille d’analyse aux schéma de dépôt des 3456 séquences sur les microréseaux, et de circonscrire et mesurer l’intensité des pixels de chaque dépôt le plus finement possible. Plusieurs logiciels ont été testé, et la solution semi-automatisée offerte par le logiciel BZScan a été retenue (BZScan, TAGC, INSERM-ERM 206, Parc scientifique de Luminy, 13288 Marseille cedex 09, France) (Lopez et al., 2004). Plusieurs méthodes d’analyse étaient proposées par le logiciel, avec prise en compte du bruit de fond local, de la surexposition de quelques dépôts, l’ajustement automatique des diamètres de la grille au diamètre exact de chaque dépôt, etc…, mais c’est finalement la solution de mesure la plus directe, sans correction, qui a entraîné les meilleures valeurs de coefficients de variation entre les réplications (<20 %).

Le logarithme des signaux d’hybridation des cibles complexes a été calculé et normalisé par la médiane des signaux de chaque microréseau. Les comparaisons de l’expression des gènes entre les 4 conditions pathologiques et le témoin ont été réalisées pour chacun des 10 animaux en calculant le ratio d’expression entre 2 conditions consécutives (muscle témoin vs lésion à 6 h, lésion à 6 h vs lésion à 2 jours, lésion à 2 jours vs lésion à 7 jours, et enfin lésion à 7 jours vs lésion à 21 jours). Entre 2 conditions, un test de t de Student a été appliqué en données appariées, et seuls les ratios d’expression au moins égaux à 1,5 ont été considérés. Chaque gène étant observé à 5 stades différents, 4 ratio successifs ont été calculés, chacun avec 3 variations d’expression possibles : 1/ pas de différence d’expression, 2/ augmentation d’expression et 3/ diminution d’expression. Pour classer chaque gène, 81 profils d’expression au cours du temps étaient possibles au total (34 : 4 comparaisons temporelles et 3 possibilités de variation pour chacune).

Résultats : Les résultats montrent que seulement 15 profils d’expression sont représentés parmi les 81 profils théoriques possibles. La majorité des séquences présentes sur le microréseau a montré une expression constante au cours du temps. Au total, 187 des 1908 gènes connus ont eu une expression variable à au moins un des stades de lésion musculaire. Parmi les 187 gènes sélectionnés, certains étant représentés plusieurs fois, il restait 131 gènes différents à expression variable. Les variations étaient les plus nombreuses dans les premiers stades lésionnels (entre muscle témoin et 6 h, puis entre 6 h et 2 jours).

Article 5 :

Gene expression profiling in skeletal muscle after the intramuscular administration of a pharmaceutical vehicle.

Ferré PJ, Concordet DC, San-Cristobal M, Tosser-Klopp G, Bonnet A, Toutain PL, Hatey F, Lefebvre HP and Liaubet L

Gene expression profiling in skeletal muscle after the intramuscular