gènes candidats
Approche
Classique
Caractérisation de gènes Etude de réulations, interactions... Donnéé de séˇquen Bioinformatique Robotisation MiniaturisationApproche
Génomique
Identification de nouvelles cibles thérapeutiques
Diagnostic, pronostic clinique Pharmacogénomique Classification, etc
Hypothèse
Expéiences
Compréhension
Ignorance
Criblage
Identification de
Approche
Classique
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Données de séquençageTechniquement, il s’agit d’utiliser les méthodes d’hybridation moléculaire sur des réseaux organisés où sont déposés sur de petites surfaces un grand nombre de séquences d’ADN. Les séquences sont des oligonucléotides synthétisés ou sont issues de banques d’ADNc constituées par un seul ou plusieurs tissus d’un organisme (banques « multi-tissus »). Ce sont les « sondes », séquences connues qui correspondent en principe à des gènes, de fonction connue ou inconnue. Les échantillons à évaluer sont les « cibles », qui sont des ADNc préparés par transcription réverse à partir des ARNm extraits sélectivement du tissu étudié. Les cibles sont marquées, le plus souvent en fluorescence ou en radioactivité (α33
P) au moment de la transcription réverse d’ARN en ADNc. Les ADNc s’hybrident à leur séquence complémentaire sur le réseau, de manière proportionnelle à leur nombre dans l’échantillon. Le marquage est révélé et son intensité pour chaque sonde est quantifiée sur le réseau par analyse d’images.
c) Transcriptome du muscle strié squelettique
Même si le transcriptome du muscle strié squelettique n’est pas intensivement analysé par rapport à d’autres tissus, nous décrirons ci-dessous brièvement quelques études publiées dans plusieurs domaines.
(1) Phénotype musculaire
Les profils d’expression de deux muscles à métabolisme différent ont été comparés par la technique des microréseaux chez la souris. Au total, une expression différentielle a été mise en évidence pour 49 gènes entre un muscle de type « blanc » glycolytique, le Quadriceps, et un muscle « rouge » au métabolisme oxydatif, le Soleus (Campbell et al., 2001). Récemment, le transcriptome musculaire a été analysé pour 5 souches de souris différentes, soit les souches CBA, BALB, BL6, DBA, et BL10 (Turk et al., 2004). Des différences ont été mises en évidence entre les 5 types génétiques pour 88 des 6144 gènes analysés (soit 1,4 %), montrant qu’il peut être difficile de comparer des souris malades et saines issues de souches différentes. Cependant, même si le nombre de gènes observés par les auteurs est grand, ils n’ont utilisé que 2 individus par type génétique pour réaliser les comparaisons (Turk et al., 2004).
Chez le porc, un microréseau à ADN a été développé avec 5500 clones issus de deux banques d’ADNc constituées par 2000 clones provenant de muscles
Longissimus dorsi de fœtus porcin de 50 jours et 3500 clones provenant de muscles
Gastrocnemius de porc nouveau-né âgé de 3 jours (Bai et al., 2003). Chaque clone a été déposé en double sur le réseau. Pour expérimenter le microréseau construit, le transcriptome de deux muscles de phénotypes énergétique et contractile différents a été évalué : un muscle de type « blanc » (Longissimus dorsi) et un muscle de type « rouge » (Psoas). Des gènes à expression différentielle attendue ont permis de valider la construction du microréseau, et une série de nouveaux gènes candidats entre les 2 types de muscle a été mise en évidence. Un ratio d’expression différentielle entre le Psoas et le Longissimus de niveau au moins égal à 2 a été considéré comme significatif, regroupant 70 séquences du microréseau, principalement des gènes d’origine mitochondriale (Bai et al., 2003).
(2) Qualité de la viande
Un travail mené par l’INRA de Theix a utilisé le transcriptome musculaire pour tenter de mettre en évidence des gènes ou des profils d’expression de gènes associés à la qualité de la viande ou au potentiel de croissance musculaire (Sudre, 2003). Des cibles issues de deux muscles bovins (Rectus abdominalis et Semitendinosus) à des stades de développement variés (110, 180, 210 et 260 jours de vie fœtale, puis 15 mois après la naissance) ont été hybridées avec des sondes hétérologues de muscle humain fixées sous forme de 1339 produits PCR sur des membranes de nylon (Sudre et al., 2003). Cette étude a montré des différences d’expression pour 110 gènes au cours de la myogenèse chez le bovin, certains ayant déjà été mis en évidence par des approches classiques, d’autres étant nouvellement décrits. L’analyse du transcriptome a aussi permis de comparer les profils d’expression de muscles de taurillons charolais issus de lignées divergentes sélectionnées sur leur potentiel de croissance musculaire. Les animaux phénotypiquement les plus extrêmes ont été testé, ce qui a montré que le fort développement musculaire est associé à un métabolisme plus glycolytique.
(3) Pathologies musculaires
La technique des microréseaux à ADN a été utilisée dans la recherche de gènes candidats impliqués dans la phase précoce de développement des lésions musculaires chez la souris (Summan et al., 2003). Ainsi, des ADNc issus de muscle tibial antérieur 24 h après induction d’une lésion par congélation ponctuelle du tissu
ont été comparés par hybridation sur des réseaux à des ADNc extraits de muscles contrôles. Histologiquement, le muscle était oedémateux, et 60 % des cellules étaient lésées, avec un influx localisé de cellules inflammatoires. Parmi les 732 séquences oligonucléotidiques présentes sur les réseaux et représentant des gènes sélectionnés et impliqués dans les phénomènes inflammatoires, la prolifération et la différenciation cellulaires ou la nécrose et l’apoptose, 6 % présentaient une expression différentielle, soit une variation d’expression d’au moins 1.7 fois par rapport au muscle contrôle. 3.2 % correspondaient à des séquences en régulation négative, majoritairement des gènes impliqués dans le métabolisme (protéines de transport ionique dans la mitochondrie, métabolisme intermédiaire) et la signalisation cellulaire. 2.8 % correspondaient à des gènes en régulation positive, principalement des gènes associés aux processus de l’inflammation, des enzymes de résistance au stress oxydatif ou de la prolifération cellulaire. Les variations observées dans le muscle 24 h après induction de la lésion permettent à le cellule de conserver son homéostasie et de mieux résister aux radicaux libres. Les chimiokines comme la MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), le M-CSF (Macrophage Colony- Stimulating Factor) et son récepteur, semblent jouer un rôle dans les phénomènes lésionnels du muscle strié squelettique et sont des gènes candidats dont l’activité physiologique précise est à découvrir pour de nouvelles approches thérapeutiques des lésions musculaires (Summan et al., 2003).