Etude des caractéristiques de l’apoptose a La morphologie des noyau

Le Hoechst 33 342 est un composé qui s’intercale entre les acides nucléiques et devient fluorescent. Il permet d’observer les changements de morphologie des noyaux au cours de l’apoptose. Tandis que la chromatine des cellules saines est répartie dans tout le noyau et se présente sous la forme d’hétérochromatine et d’euchromatine, celle des cellules apoptotiques est condensée et intensément lumineuse et colorée. Le noyau des cellules apoptotiques est fragmenté (voir introduction).

Pour analyser les changements morphologiques du noyau après les traitements, les cellules sont cultivées sur des lamelles de microscopie, stérilisées par de l’alcool flambé, et placées dans le fond

aglycone (comme décrit précédemment). 24h après le début du traitement, le milieu est éliminé et remplacé par une solution de Hoechst 33 342 (0,02 mg/ml) pendant 10 minutes. Les lamelles sont alors retournées sur une lame de verre et observées à l’aide d’un microscope à fluorescence sous un filtre UV.

b. La fragmentation de l’ADN génomique

La fragmentation de l’ADN génomique qui survient lors de la mort par apoptose est analysée par électrophorèse (figure 27). L’extraction de l’ADN génomique est réalisée en suivant le protocole publié par Kanno et al (2004).

Les cellules sont ensemencées et traitées comme décrit précédemment. Au temps indiqué, les cellules (au moins 4 millions) sont décollées à l’aide d’un grattoir, prélevées et centrifugées 5 minutes à 300 g. Le culot est lavé dans 5 ml de PBS 1X et centrifugé à nouveau. Le culot peut être gardé à -80°C jusqu’au jour de l’extraction.

Les cellules sont lysées dans 100 µl de tampon contenant Nonidet P40 1% (Fluka), SDS 1%, EDTA 20 mM pH 8 et Tris-HCl 50 mM pH 7,4. Le lysat est incubé 3 heures en présence de protéinase K (concentration finale 100 µg/ml) à 56°C puis la nuit en présence de RNase A (concentration finale 10 µg/ml) à 37°C. L’ADN est extrait en ajoutant un volume égal au lysat (environ 200 µl) de phénol alcalin (saturé en Tris-HCl pH 8,8)-chloroforme- alcool isoamylique (25:24:1, Biolsolv). Après une agitation vigoureuse de 10 secondes, une solution laiteuse et homogène est obtenue. Les tubes sont incubés 20 minutes dans la glace puis centrifugés 15 minutes à 10 000 g à 4°C. Deux phases apparaissent alors, la phase supérieure étant la phase aqueuse contenant l’ADN. Elle est prélevée délicatement en évitant de prélever la phase inférieure. Un volume de phénol/chloroforme/alcool isoamylique, équivalent au volume prélevé (environ 250 µl), est à nouveau ajouté, puis le mélange est vortexé, incubé dans la glace et centrifugé. La phase supérieure est prélevée très délicatement sans prélever la phase organique. Deux volumes d’éthanol absolu (environ 400 µl), équivalent au volume prélevé, sont ajoutés. Les échantillons sont incubés 20 minutes à -20°C et centrifugés 15 minutes à 10 000 g et à 4°C. Le surnageant est éliminé très délicatement. Le culot est repris dans 30 µl de tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8) et incubé au moins 1 heure à 50°C. La solution d’ADN est alors dosée à 260 nm. Les échantillons sont déposés sur un gel d’agarose à 1,4% dans du TAE 0,5X. L’électrophorèse est réalisée sous 50 V et dure jusqu’à ce que le front de migration arrive à un centimètre du bas du gel. Le gel est incubé 20 minutes dans un bain de BET puis 20 minutes dans un bain d’eau. Le gel est observé sous lumière UV.

c. Détection de l’apoptose par la technique TUNEL

La technique TUNEL (pour terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling) est basée sur le marquage des extrémités des fragments d’ADN produits au cours de l’apoptose. La transférase terminale catalyse la polymérisation de nucléotides conjugués à la fluorescéine sur les extrémités 3’OH libres d’ADN.

Les cellules MCF-7 sont traitées par le complexe Fe(III)-HQ 5 µM ou par H2O2 700 µM. Elles sont

collectées 24 heures après le début des traitements à l’aide d’un grattoir et centrifugées 5 minutes à 300 g. Le culot est lavé par 5 ml de PBS 1X et centrifugé à nouveau. Les cellules sont fixées dans 1 ml de PFA 2% pendant 30 minutes puis centrifugées. Le culot est lavé dans 5 ml de PBS 1X et centrifugé. Les cellules sont perméabilisées par une solution de triton X-100 0,1% dans du citrate de sodium 0,1% pendant 2 minutes dans la glace. Un autre lavage est réalisé par 5 ml de PBS suivi d’une centrifugation.

La solution de marquage du kit (In situ cell death detection kit, fluorescein, Roche) est préparée en mélangeant, pour un échantillon, 5 µl de solution de transférase terminale à 45 µl de solution de marquage, contenant les nucléotides conjugués à la fluorescéine. Les cellules sont réparties en deux lots équivalents. Une partie des cellules est incubée, 60 minutes à 37°C dans le noir, en présence de 50 µl du mélange enzyme + solution de marquage. Les cellules contrôles sont incubées en présence de 50 µl de solution de marquage en absence d’enzyme. Après deux lavages au PBS, comme précédemment, les échantillons sont analysés en cytométrie en flux. L’émission TUNEL est observée avec le photomultiplicateur Fl-1. Le pourcentage des cellules hautement marquées en TUNEL est déterminé suivant l’analyse des données présentée dans la figure 45.

Figure 45 : Détermination du pourcentage de cellules TUNEL-positives. L’intensité de

fluorescence est fonction de la proportion d’ADN fragmenté. Un traitement pro-apoptotique entraîne donc un décalage de la fluorescence vers les grandes intensités (vers la droite). Le contrôle négatif est tout d’abord défini en analysant l’échantillon incubé en présence de solution de marquage sans enzyme. Les cellules sont considérées positives lorsque leur fuorescence est supérieure à celle du contrôle négatif, la formule indiquée est donc appliquée aux échantillons

d. La dépolarisation des membranes mitochondriales

Les changements de polarisation de la membrane mitochondriale sont évalués en utilisant le DiOC6(3) (dihexyloxacarbocyanine iodide), un colorant cationique lipophile qui s’accumule dans

les mitochondries polarisées.

Le DiOC6(3) est solubilisé dans du DMSO pour réaliser une solution stock à 40 mM qui est diluée

extemporanément dans du milieu complet.

Afin de servir de contrôle positif de la dépolarisation des mitochondries, des cellules contrôles sont traitées par du CCCP (carbonyl cyanide m-cholorophenylhydrazone). La solution de CCCP est préparée à 20 mM dans l’éthanol absolu et conservée à -20°C. La solution stock est diluée extemporanément dans du PBS.

Les cellules sont collectées comme précédemment et lavées dans 5 ml de PBS. Un lot de cellules contrôle est séparé et traité pendant 15 minutes par le CCCP 200 µM. Les cellules sont ensuite incubées en présence de DiOC6(3) pendant 30 minutes à 37°C dans le noir. Les échantillons sont

centrifugés et les culots sont lavés dans 5 ml de PBS avant d’être à nouveau centrifugés et analysés en cytométrie en flux (figure 46). Le pourcentage de cellules hautement marquées par le DiOC6(3)

est déterminé.

Figure 46 : Détermination du pourcentage de cellules hautement marquées par le DiOC6(3). L’intensité de fluorescence

est fonction de la proportion de mitochondries dont la membrane est polarisée. La dépolarisation des membranes mitochondriales entraîne un décalage de la fluorescence vers les petites intensités (vers la gauche). Dans l’exemple présenté, les cellules contrôles hautement marquées par le DiOC6(3) représente 83,3%. Les cellules

traitées par le complexe Fe(III)-HQ possèdent une grande majorité de mitochondries dépolarisées, les cellules hautement marquées par le DiOC6(3) ne représentent que 3% des cellules totales.