Etat corporel et homéostasie énergétique des juments

2.1.2.1. Poids et notes d’état des juments gravides et allaitantes

Les juments gravides et allaitantes ont été pesées et leur état corporel a été évalué (Figure 39) (attribution d’une note d’état de 1 à 5 (Arnaud, 2000)). L’ensemble de ces mesures a été réalisé par les techniciens expérimentés des deux stations expérimentales, souvent aidés par des stagiaires (BTS, DUT, vétérinaires) présents sur le terrain.

2.1.2.2. Statut énergétique des juments gravides et allaitantes

Le statut énergétique des juments gravides et allaitantes a été évalué via le dosage plasmatique des acides gras non-estérifiés et de la leptine. La concentration plasmatique en acides gras non-estérifiés est un marqueur de la lipomobilisation des triglycérides stockés dans le tissu adipeux. Son augmentation reflète un déficit énergétique de l’organisme. La leptine est sécrétée par les adipocytes et reflète donc la quantité de tissu adipeux. Les acides gras non-estérifiés ont été dosés par Mme Ternois de l’INRA de Paris à l’aide d’une méthode enzymatique colorimétrique utilisant l’appareil Cobas Mira (Roche, Mannheim, Allemagne) et le kit commercial NEFA-HR(2) (Wako Chemical, Allemagne). J’ai dosé la leptine par une méthode radio-immunologique avec le Dr. Camous qui a mis au point cette technique (Salazar-Ortiz et al, 2011).

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2.1.2.3. Homéostasie glucidique des juments gravides du modèle 2

2.1.2.3.1. Effets de l’apport d’orge sur la glycémie et l’insulinémie au quotidien

Environ deux semaines après le début des régimes C et F (en décembre, au début du 8^ème mois de gestation), des prélèvements de sang ont été collectés toutes les heures sur une période de 10 heures (début à 8:30 et fin à 18:30) couvrant les deux repas (distribués à 8 :45 et 15 :45). La glycémie a été immédiatement mesurée avec un glycomètre (Medisense Optium Xceed, Abbott, Etats-Unis), tandis que les échantillons de plasma ont été conservés à -20°C jusqu’au dosage de l’insuline. J’ai réalisé ce test avec M. Dubois et M. Bellonie de la station de l’IFCE. J’ai réalisé quelques dosages d’insuline, mais la plupart ont été réalisés par le Dr. Guillaume par une méthode radio-immunologique qu’il a mise au point (Salazar-Ortiz et al, 2011).

2.1.2.3.2. Effets de l’apport d’orge sur la tolérance au glucose

Des tests intraveineux de tolérance au glucose (intravenous glucose tolerance tests, IVGTT) ont été réalisés chez les juments gravides une première fois avant le début des régimes C et F (en août, au 3^ème mois de gestation) et une seconde fois après qu’ils aient commencé et avant la parturition (au mois de février, au 9^ème mois de gestation).

Le principe de l’IVGTT est d’administrer un bolus de glucose par voie intraveineuse à l’individu et de mesurer les concentrations plasmatiques en glucose et en insuline en réponse à l’injection. Cette procédure permet de déterminer la capacité de l’organisme à normaliser sa glycémie, i.e., sa tolérance au glucose et la sécrétion d’insuline des cellules β du pancréas.

Après une période de jeûne d’une nuit, les juments ont été perfusées avec 0,25 g/kg de glucose 30% (BBraun, Allemagne) via un cathéter placé dans la veine jugulaire sur une période de 5 minutes. Des échantillons de sang veineux ont été prélevés sur tube EDTA à -5, 5, 7, 9, 12, 15, 30 et 60, 90, 120, 150 et 180 minutes après le début de la perfusion. La glycémie a été immédiatement mesurée avec un glycomètre (Medisense Optium Xceed, Abbott, Etats-Unis), tandis que les échantillons de plasma ont été conservés à -20°C jusqu’au dosage de l’insuline. J’ai réalisé tous les IVGTT des juments gravides avec M. Dubois et M. Bellonie de la station de l’IFCE, et avec l’aide de Mlle Valentino dans le cadre de son master 2.

Après normalisation des données de glycémie et d’insulinémie par rapport aux valeurs à -5 minutes, les aires sous courbes des réponses glycémiques et insulinémiques ont été calculées avec la méthode des trapèzes sur toute la période de prélèvement (soit 185 minutes). J'ai réalisé l’ensemble de ces analyses.

Figure 40. Photographie de l’allantochorion à

terme d’une jument de trait. Le placenta est présenté dans une configuration « en F ». La surface microcotylédonnaire est tournée vers l’extérieur. La plaque en plexiglas quadrillée (carreaux de 10 cm de côté) permet de mesurer la surface de l’allantochorion avec le logiciel ImageJ.

Figure 41. Photographie d’une coupe transversale de l’allantochorion équin à terme (à gauche) et

agrandissement des villosités microcotylédonnaires (à droite), colorés à l’hématoxyline/éosine. A : allantoïde, VA : vaisseau allantoïdien, CA : conjonctif allantoïdien, THI, trophoblaste histotrophe, M : villosités microcotylédonnaires, VM : vaisseau microcotylédonnaire, THE : trophoblaste hémotrophe et CM : conjonctif microcotylédonnaire.

Figure 42. Schéma d’une analyse stéréologique sur un échantillon d’allantochorion à terme. Un dipôle est

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2.1.3. Fonction de transfert du placenta à terme

A ce jour, les placentas des deux modèles ont été analysés, mais je présenterai uniquement les résultats issus du modèle 1 dans cette thèse.

2.1.3.1. Morphométrie du placenta et prélèvement des échantillons

A la délivrance, un échantillon d’allantochorion (15 cm x 15 cm) a été immédiatement prélevé à proximité du cordon ombilical et traité pour analyse ultérieure en histologie et en stéréologie et pour analyse de l’expression de gènes candidats. Puis, l’ensemble des annexes fœtales (allantochorion et amnios) a été pesé. L’allantochorion a été photographié dans la configuration typique « en F » (Figure 40) sous une plaque en plexiglas transparent quadrillée (carreaux de 10 cm x 10 cm) afin que la surface de l’allantochorion puisse être mesurée avec le logiciel ImageJ. Le volume de l’allantochorion a été mesuré par immersion, mais uniquement dans le cadre du modèle 2. Ces données de volume ont permis d’établir une relation linéaire entre le poids et le volume de l’allantochorion. Cette relation a été utilisée pour calculer le volume de l’allantochorion dans le cadre du modèle 1. J’ai participé aux prélèvements d’échantillons d’allantochorion lors des naissances des printemps/été 2012 à la station de l’UEPAO. Lors des autres saisons de reproduction, ce sont les techniciens des stations qui se sont chargés de leur collecte.

2.1.3.2. Histologie et stéréologie de l’allantochorion

Trois fragments (1 cm x 1 cm) de l’échantillon d’allantochorion ont été fixés en formol 4%, puis conservés en tampon phosphate salin à 4°C. Après inclusion en paraffine, les échantillons ont été coupés à 7 µm d’épaisseur et colorés par l’hématoxyline/éosine (Figure 41). Une première observation microscopique des coupes a été suivie d’une analyse stéréologique avec le module One Stop Stereology (Reed et al, 2010) du logiciel Mercator (Explora Nova, Hamamatsu, Japon). La stéréologie est une évaluation quantitative (nombre, longueur, surface ou volume) d’une structure en 3 dimensions à partir de sections en 2 dimensions. Les propriétés de ces structures dans l’espace sont quantifiées en «jetant» aléatoirement des sondes (dipôles) dans cet espace, et en repérant chaque entrée de la sonde dans une nouvelle structure. Dans cette étude, la surface et le volume relatifs du trophoblaste hémotrophe, du trophoblaste histotrophe, des vaisseaux des microcotylédons, des vaisseaux allantoïdiens et du conjonctif allantoïdien ont été mesurés pour tous les échantillons d’allantochorion (Figure 42). Ces données, rapportées au volume total de l’allantochorion, permettent d'évaluer la surface et le volume absolus de chacune de ces structures. J’ai réalisé les inclusions et les colorations et Mlle Valentino et Mlle Robles ont mené les analyses stéréologiques dans le cadre de leur master 2.

Figure 43. Schéma des mensurations réalisées chez les poulains. L’animal doit être calme et d’aplomb sur ses

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2.1.3.3. Expression de gènes candidats dans l’allantochorion

Dix fragments (0,5 cm x 0,5 cm) de l’échantillon d’allantochorion ont été congelés dans l’azote liquide et conservés à -80°C. Les amorces sens et anti-sens de 15 gènes candidats ont été dessinées et, après extraction des ARN totaux en solution D (Chomczynski et Sacchi, 1987), l’expression de ces gènes a été mesurée par RT-qPCR (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction) avec la technique du SYBR Green. Il s’agit de gènes codant des facteurs de croissance fœto-placentaire et leurs récepteurs (H19, IGF-II, IGF-IR, IGF-IIR, EGF-R et TGF_β1), des transporteurs du glucose (SLC2A1), des acides aminés (SLC38A1, SLC38A2), des lipides (CD36) ou des enzymes impliquées dans l’hydrolyse des triglycérides (LPL), des facteurs responsables de la vascularisation du tissu (VEGF_A, Flt1, KDR et eNOS). Trois gènes de référence ont été sélectionnés avec geNorm (GAPDH, RPL32, SCAMP3) et l’expression relative des 15 gènes candidats a été calculée avec le logiciel QBase+. J’ai réalisé les extractions d’ARN avec l’aide de Mme Dahirel, Mlle Valentino a dessiné les amorces et réalisé les RT-qPCR et le Dr. Tarrade a traité les données brutes obtenues.