Chapitre IV : APPLICATION À L’ÉPIGÉNÉTIQUE
IV- 2-3-3 ET LEURS CONSÉQUENCES : LES PATHOLOGIES CANCÉREUSES, UN
EXEMPLE.
Les pathologies cancéreuses sont souvent associées à un dysfonctionnement des
systèmes de contrôle du cycle cellulaire ce qui entraine une prolifération incontrôlée. Les différentes étapes du cycle cellulaire sont sous dépendance de l’expression différentielle des gènes qui gouvernent les processus de réplication, de différentiation et d’apoptose. Ainsi, une désorganisation du contrôle épigénétique peut être à l’origine du développement de cancers.
En 1983, Feinberg et Volgelstein(127) ont mis en évidence l’existence d’une
hypométhylation des régions promotrices de certains gènes spécifiques chez des patients atteints d’adénocarcinome du colon ou de carcinome pulmonaire comparé au degré de méthylation retrouvé chez des sujets sains. De plus, ils ont pu montrer que ce degré d’hypométhylation était corrélé à l’importance du développement des lésions tumorales. Cette hypométhylation provoque une augmentation de la transcription de ces gènes qui ont par la suite été identifiés comme des gènes activateurs de tumeurs ou proto-oncogènes(128).
Inversement, des phénomènes d’hyperméthylation au niveau de régions
promotrices de gènes suppresseurs de tumeurs entrainent une diminution de l’expression de ces derniers ce qui peut favoriser l’apparition de pathologies prolifératives.
De plus, il a été observé que la méthylation des motifs CpG provoquait une instabilité de la cytosine qui était alors substituée par une base thymine (figure 36). Le remplacement de la cytosine par la thymine induit, après transcription et traduction, une modification de la séquence peptidique pouvant aboutir à la synthèse d’une protéine non fonctionnelle ou dotée de propriétés différentes(129). Figure 36 : Représentation de la structure chimique de la cytosine, de son dérivé méthylé et de la thymine qui présente une forte homologie structurale avec la 5-méthylcytosine.
A ces phénomènes aberrants d’hypo ou d’hyperméthylation des régions
promotrices des gènes s’ajoutent des processus non contrôlés d’acétylation et de méthylation des histones qui perturbent la structure de la chromatine et modulent
l’expression des gènes. NH N H O O N N H NH2 O
cytosine
N N H NH2 O5-méthylcytosine
thymine
Tout comme il existe un code génétique associant un codon ARN à un acide aminé, il est possible de définir un code histone permettant de corréler la nature des modifications post-traductionnelles des histones au degré d’expression des gènes (figure 37). Figure 37 : Représentation simplifiée du code histone au sein d’une cellule saine (en haut) et d’une cellule tumorale (en bas). Illustration issue de la référence (130). Des travaux de cartographie des MPT des histones ont montré que l’acétylation des histones est traditionnellement associée à une transcription active des gènes. En revanche, le rôle fonctionnel de la méthylation des histones dépend du nombre de substituants et de leurs localisations sur la queue de l’histone. Ainsi, la lysine 4 di et triméthylée et la lysine 9 monométhylée de l’histone H3 constituent des motifs de transcription active des gènes car ils permettent d’obtenir une chromatine structuralement relâchée. Au contraire, la di et/ou triméthylation des résidus lysines en position 9 et 27 de l’histone H3 entrainent une répression des gènes via la formation d’une chromatine structuralement inactive(131)(132).
Les mêmes études réalisées sur des lignées cellulaires cancéreuses gastriques et prostatiques ont montré une perte globale du caractère acétylé des histones associée à une surexpression des enzymes histone-désacétylases. De même, les motifs de méthylation font l’objet de profondes modifications qui sont associées à une expression anormale des enzymes histone-méthyltransférases. Des surexpressions des enzymes EZH2 et G9a responsables de la méthylation des lysines 9 et 27 de l’histone H3 ont été retrouvées chez des patients atteints de cancer du sein, de la prostate et du foie(133).
Les implications physiopathologiques des modifications post-traductionnelles des histones au niveau épigénétique justifient donc pleinement le développement
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Chapitre I : PRÉSENTATION DU PROJET DE THÈSE ET DE SES PROBLÉMATIQUES
L’objectif de ce sujet de thèse est d’élaborer un système de détection permettant la reconnaissance sensible et spécifique d’un biocomposé d’intérêt présent en faible concentration au sein d’environnements biologiques complexes, tels que des lysats cellulaires, des cultures cellulaires ou encore du sang total. Ce biocomposé cible, noté H4K16 est l’histone H4 acétylée sur le résidu lysine en position 16.
Afin de construire un système de détection qui soit le plus performant possible, nous allons réaliser un assemblage moléculaire qui combinera les propriétés optiques et électroniques uniques des nanomatériaux avec les propriétés de reconnaissance des aptamères.
Ce système de détection sera composé d’un support solide sur lequel sera immobilisé un système de reconnaissance associé à un reporteur capable de transcrire l’interaction entre le système et sa cible en un signal physique facilement mesurable par des appareils de mesure conventionnels.
Le support solide sera constitué de nanoparticules d’or, le système de reconnaissance sera assuré par un aptamère spécifiquement dirigé contre la modification post-traductionnelle d’intérêt H4K16, enfin une molécule fluorescente dérivée de la rhodamine ou de la fluorescéine servira de reporteur optique.
La localisation nucléaire de la cible ainsi que sa nature protéique nécessitent d’utiliser ce dispositif au sein de milieux biologiques complexes ce qui soulève de nombreuses problématiques. La première d’entre elles est que ce système doit être hydrosoluble et stable dans des conditions de température, de force ionique et de pH compatibles avec la stabilité des biocomposés et assurant la survie cellulaire. Cette biocompatibilité permettra, à terme, d’utiliser ce système de détection in-vitro ou in- vivo.
Afin de répondre à ce critère, les nanoparticules d’or seront synthétisées en phase aqueuse, sans utiliser d’agent de transfert de phase potentiellement cytotoxique. De plus, les réactions de fonctionnalisation et de bioconjugaison des nanoparticules avec le motif de reconnaissance devront également être réalisées en respectant ces mêmes exigences de biocompatibilité.
La deuxième question soulevée par une utilisation en milieu biologique complexe est la stabilité du système vis-à-vis des différents constituants biologiques éventuellement présents au sein de l’échantillon à tester et qui peuvent entrainer la dégradation de cet assemblage moléculaire.
La solution proposée pour prévenir cette détérioration est d’introduire des synthons pegylés entre la nanoparticule et l’aptamère qui joueront le rôle de bras espaceur. L’une des extrémités de ces synthons sera fonctionnalisée par un groupement
thiol afin de permettre son ancrage à la surface des nanoparticules d’or via une liaison covalente de grande stabilité. L’autre extrémité sera fonctionnalisée par différents groupements permettant dans un deuxième temps de réaliser le couplage avec l’aptamère.
Un autre problème concerne le risque d’interférences du motif de reconnaissance avec les autres constituants non ciblés du milieu ce qui peut entrainer une baisse signification de la spécificité de la détection.
Afin de garantir la meilleure spécificité de ce dispositif, l’aptamère peut être sélectionné par un processus SELEX avec une haute spécificité et une haute affinité pour sa cible.
Après l’étape de SELEX, le séquençage de l’aptamère de reconnaissance sélectionné sera réalisé et le motif nucléotidique sera synthétisé. Cette étape de synthèse post-SELEX permettra de fonctionnaliser l’une des extrémités de l’aptamère afin de permettre son ancrage sur la nanoparticule d’or ou son couplage avec le bras espaceur.
La présence d’une fonction terminale soufrée sur l’aptamère va permettre sa fixation sur la nanoparticule d’or via la formation d’une liaison covalente Au-S. En revanche, une fonctionnalité azoture, alcyne, amine ou acide permettra de coupler ce motif de reconnaissance moléculaire au bras espaceur pegylé via des réactions de chimie click ou de couplage peptidique.
L’une des stratégies de détection envisagées dans cette étude repose sur les propriétés optiques et électroniques des nanoparticules d’or et plus particulièrement le quenching de fluorescence. L’aptamère de reconnaissance immobilisé à la surface de la nanoparticule d’or va être apparié à un brin complémentaire pour s’organiser en un duplex typique de la double hélice de l’ADN. Le marquage préalable de ce brin complémentaire avec un fluorophore dérivé de la fluorescéine permettra d’obtenir un système reporteur capable de traduire la reconnaissance et l’interaction entre le ligand aptamère et sa cible épigénétique H4K16 acétylée.
Notre hypothèse de travail est que le fluorophore porté par le bras complémentaire est suffisamment proche de la surface de la nanoparticule pour que ses propriétés de fluorescence soient inhibées par les électrons de conduction.
Cependant, lorsque la cible est présente, l’interaction entre l’aptamère et l’histone cible va générer une modification de la conformation de ce dernier et rompre l’association duplex. Le bras complémentaire est alors libéré dans le milieu et la distance avec la nanoparticule devient alors trop importante pour maintenir ce quenching ce qui permet de restaurer la fluorescence qui pourra alors être mesurée par spectrofluorimétrie (schéma 32).
Schéma 32 : Stratégie de détection de marque épigénétique utilisant les propriétés de quenching de fluorescence des nanoparticules d’or ainsi que la grande flexibilité conformationnelle des aptamères comme système de transduction du signal.
Un autre mode de détection a également été envisagé en utilisant les propriétés
colorimétriques des suspensions colloïdales de nanoparticules d’or. En effet, nous avons vu précédemment que la coloration de ces solutions était fonction de la taille, de la forme ainsi que du degré d’agrégation des nanoparticules qui les composent. Cette caractéristique peut être mise à profit pour élaborer un système de détection fondé sur l’affinité différentielle d’un aptamère entre sa cible et son brin complémentaire.
CHAPITRE II : SYNTHÈSE ET FONCTIONNALISATION DU LIGAND II-1 ÉTUDE DU LIGAND EN SÉRIE PEG4 II-1-1 HÉTÉROFONCTIONNALISATION DU LIGAND La fonctionnalisation des nanoparticules d’or repose sur la forte affinité entre les atomes de soufre (S) et d’or (Au) ce qui permet la formation d’une liaison covalente Au-S stable.
Cette fonctionnalisation nécessite donc la présence d’un ligand porteur d’une fonction thiol. Les AuNPs peuvent donc être directement fonctionnalisées par des aptamères porteurs de groupements fonctionnels thiols. Cependant, afin d’améliorer la stabilité et/ou la biodisponibilité des ces structures nanoparticulaires au sein de milieux biologiques complexes, un bras espaceur peut être inséré entre la nanoparticule d’or et le biosenseur. Pour ce bras espaceur, également appelé linker, nous avons choisi d’utiliser une chaine tétraéthylène glycol (PEG4). Ce motif PEG4 est constitué de quatre
répétitions d’unité éthyloxy (-CH2CH2O-).
Dans un premier temps, nous nous sommes intéressé à la synthèse d’un bras espaceur pegylé permettant le couplage avec la nanoparticule d’or (AuNPs) via une liaison covalente Au-S et la conjugaison avec l’aptamère via une chimie click. Cela a nécessité la synthèse d’un bras espaceur hétéro-bi-fonctionnalisé portant un groupement thiol à l’une de ses extrémités et un groupement azoture à l’autre (schéma 33). Schéma 33 : Schéma de synthèse du ligand tétraéthylène glycol porteur d’une fonction thiol à l’extrémité α et d’un groupement azoture à l’extrémité ω. A) Et3N, TsCl, DCM, de 0°C à température ambiante ; B) NaN3, Acétone, Reflux ; C) NaOH, TsCl, THF, de 0°C à température ambiante ; D) TrSH, NaI, K2CO3, Acétone, sous
Argon ; E) AcSK, EtOH absolu, Reflux, Argon ; F) Hydrolyse acide, Et3SiH, TFA, Argon ; G) Hydrolyse
basique, NaOH, Argon.
Pour réaliser ce linker, il a fallu dans un premier temps fonctionnaliser l’une des extrémité OH libre du PEG4 (B0) par un groupement nucléofuge, et ce de façon
régiosélective. HO O3 OH HO O3 OTs HO O 3 N3 TsO O 3 N3 B0 B1 B2 B3 TrS O3 N3 B4 AcS O 3 N3 B5 HS O 3 N3 L0 A B C D F E G
Concernant la nature du groupement partant nucléofuge, nous nous sommes orienté vers un groupement tosyle (Ts), aisément obtenu par une réaction de substitution nucléophile de type SN2 entre l’alcool terminal du PEG4 et le chlorure de
tosyle TsCl. Cette réaction, dont le mécanisme est représenté sur le schéma 34, a été effectuée en présence d’une base comme la triéthylamine Et3N qui permet d’accélérer la cinétique de la réaction. De plus, afin d’assurer une monotosylation régiosélective, la réaction a été réalisée en présence d’un très large excès de PEG4 (10 Eq). Schéma 34 : Mécanisme réactionnel de la réaction de tosylation en présence de triéthylamine.
La réaction a conduit à l’obtention d’un mélange des composés B0 et B1. L’isolation du produit de réaction B1 repose sur l’hydro-solubilité préférentielle du réactif de départ B0. En effet, bien que les composés B0 et B1 soient tous les deux solubles dans des solvants organiques halogénés tels que le dichlorométhane (DCM), le composé B0 présente une solubilité supérieure dans l’eau. Ainsi, après extraction du produit de réaction avec du DCM, il a été possible d’isoler le produit d’intérêt B1 en éliminant le composé de départ B0 par des lavages successifs avec de l’eau. Il est également à noter que l’élimination de ce composé B0 est favorisée par des lavages successifs avec une solution aqueuse saline saturée.
Une fois le composé B1 isolé, une réaction d’azidation a été mise en œuvre afin d’obtenir la fonction azoture terminale qui permet de conjuguer ce linker avec un différentes biomolécules porteuses d’une fonction alcyne terminale via une réaction de chimie click. Cette réaction d’azidation qui conduit à l’obtention du composé B2 a été réalisée à partir du composé B1 en présence d’azoture de sodium en excès et en chauffant le milieu réactionnel à reflux. Initialement, cette réaction était réalisée dans un mélange DMF/Acétone en proportion 1/1, cependant, des rendements similaires ont été obtenus en réalisant cette azidation dans l’acétone uniquement. L’utilisation d’un mélange DMF/Acétone lors de cette réaction avait pour but de favoriser la dissociation de l’azoture de sodium et de favoriser la réaction d’azidation. Le caractère dissociatif de ce mélange est corrélé aux constantes diélectriques des solvants qui le compose, à savoir 36,70 et 21,01 pour le DMF et l’acétone respectivement. La substitution du mélange binaire DMF/Acétone par de l’acétone pure présente de nombreux avantages. Tout d’abord, la température nécessaire pour obtenir le reflux du milieu réactionnel est fortement abaissée (de 160°C à 60°C) ce qui réduit les risques HO O 3 O B0 H S O O Cl HO O3 O H S O O N - Cl- HO O 3 O B1 S O O - HCl - Et3N
de dégradations thermiques éventuelles bien que les composé pegylés soient relativement thermostables. De plus, lors de l’utilisation du DMF, une étape supplémentaire de lavage acide en présence de HCl 6N est nécessaire afin d’éliminer ce solvant. Cette étape n’est plus utile en présence d’acétone seule.
La fonction alcool restante en position α a alors été convertie en groupement thiol afin de permettre la formation d’une liaison covalente stable entre le groupement hydroxy du composé B2 et la nanoparticule d’or. La conversion de cet alcool terminal en thiol a également nécessité le passage par un synthon intermédiaire tosyle, le composé
B3. Deux conditions de synthèse ont été envisagées pour cette deuxième réaction de tosylation (schéma 35).
Schéma 35 : Présentation des deux voies de synthèse testées pour la seconde réaction de tosylation.
La première voie est identique à celle mise en œuvre pour l’obtention du composé B1, à savoir une tosylation du composé B2 à partir de TsCl et en présence de Et3N et n’en diffère que par la stoéchiométrie mise en jeu. Avec cette voie de synthèse,
les rendements obtenus ont été excellents, de l’ordre de 84%, mais le composé B3 ainsi obtenu devait être purifié par flash chromatographie. Par comparaison, une voie de synthèse alternative utilisant NaOH comme base a permis d’obtenir des rendements supérieurs (91%). De plus, le composé B3 n’a pas eu besoin d’être purifié par des techniques chromatographiques.
Le composé B3 ainsi obtenu peut ensuite être fonctionnalisé en groupement thiol, soit directement en présence de thiourée, soit indirectement via un groupement protecteur de la fonction thiol. La stratégie de synthèse impliquant un groupement protecteur a été privilégiée.
En effet, le groupement thiol est sensible à l’oxydation au contact de l’oxygène de l’air pour former un mélange de composés thiol et disulfures. Pour éviter cette oxydation et faciliter la manipulation et le stockage du composé thiol L0, deux types de groupement protecteurs ont été envisagés.
Le premier groupement protecteur est un motif tritylthiol (TrSH, composé B4) hydrolysable en groupement thiol dans des conditions acides alors que le deuxième groupement protecteur est un motif thioacétate (composé B5) convertit en thiol libre
après une étape d’hydrolyse en milieu basique. HO O3 N3 TsO O 3 N3 B2 B3 TsCl, Et3N DCM 0°C to RT R=84% HO O3 N3 TsO O 3 N3 B2 B3 TsCl, NaOH THF 0°C to RT R=91%
La synthèse de ce ligand hétérofonctionnalisé est représentée sur le schéma et le protocole détaillé de la synthèse de ces différents composés est répertorié dans la section expérimentale de ce manuscrit.