R´esultats de simulations 2D

A complexidade das rotas metabólicas e a enorme diversidade de respostas celulares aos sinais intracelulares e extracelulares, levaram ao desenvolvimento de novas técnicas para varredura e estimativa do comportamento global da célula em resposta a estímulos de interesse. Uma das técnicas desenvolvidas foi o sequenciamento de nova geração (NGS, do inglês Next-Generation Sequencing). O NGS é uma nova ferramenta desenvolvida na área de genética, genômica e epigenômica, que elevou a qualidade da análise e reduziu os custos da pesquisa (HAYDEN et al., 2009). Com a ferramenta, pesquisadores tem acesso ao genoma celular e são capazes de investigar uma série de fenômenos, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único (CRAIG et al., 2008), eventos epigenéticos (PARK, 2009), expressão diferencial (BLOOM et al., 2009), ou mesmo splicing alternativo (SULTAN et al., 2008).

O sequenciamento de RNA (RNAseq) é uma aplicação de notada efetividade, cuja metodologia foi melhorada a partir de tecnologias prévias como ensaios de microarrajos de DNA e analise seriada da expressão gênica (SAGE, do inglês sequencing analysis of gene expression) (CLOONAN et al., 2009). O RNAseq utiliza a tecnologia do NGS para sequenciar, mapear e quantificar populações de transcritos celulares (MORTAZAVI et al., 2008; MOROZOVA et al., 2009). Apesar de recente, a estratégia fornece informações sem precedentes sobre a complexidade transcricional de diversos organismos, dentre eles, humanos (SULTAN et al., 2008).

O NGS pode ser obtido a partir de diferentes plataformas, dentre elas a plataforma 454 Genome Sequencer FLX, _{Illumina’s Genome Analyzer, SOLiD Applied} Biosystems e Ion Torrent (CLOONAN et al., 2008; EVELAND et al., 2008; MARIONI et al., 2008). As plataformas, apesar de distintas, usam métodos de sequenciamento de RNA semelhantes. Inicialmente, o RNA é isolado da célula, fragmentado em posições aleatórias e copiados em uma fita da DNA complementar (cDNA). Para os próximos passos, os fragmentos são selecionados de acordo com o tamanho específico (200-300 bases, por exemplo) e submetidos à amplificação por PCR. Uma vez amplificadas, as moléculas de cDNA são sequenciadas usando NGS, e as reads resultantes são alinhadas com um genoma de referência. A quantidade de reads alinhadas com cada gene do genoma de referência é tabulado e, sua contagem, ou medidas de expressão gênica digital (MED) pode ser usada para testes de expressão diferencial (MORTAZAVI et al., 2008). O processamento e análise das listas de transcritos geradas pelo sequenciamento é realizado com auxílio de análise computacional e da Biologia de Sistemas.

As interações complexas por traz do sistema da imunidade inata, o qual resulta em uma resposta efetiva do hospedeiro em condições normais, e doenças inflamatórias quando perturbado, pode ser dissecada de uma maneira compreensiva através de ferramentas de biologia de sistemas. A Biologia de Sistemas é uma ferramenta de estudo e organização de dados que tem como base as interações entre componentes de um sistema e a relevância dessas interações para funções e processos desse sistema. Proteínas, metabólitos ou RNAs envolvidos em uma via metabólica são exemplos de componentes de um sistema. Com o auxílio da Biologia de Sistemas é possível transformar dados computacionais em vias e processos celulares e, a partir disso, formular hipóteses e mensurar possíveis experimentos para comprovação de comportamentos celulares. (ALBERT, 2005). Dos dados brutos gerados pelas plataformas de sequenciamento até a representação gráfica de processos celulares, são realizados testes e cálculos matemáticos. Uma das formas de representação de resultados é pela Teoria dos Grafos. Grafos são representações gráficas de componentes de um sistema que, de alguma maneira, interagem entre si, podendo formar redes de interações (BARABASI e OLTVAI, 2004) (Figura 9). Em um grafo, um nó representa uma unidade, ou seja, um componente do sistema que, caso interaja com outro nó, compartilhará com este um conector. Desta maneira, entende-

se que só haverá conector havendo no mínimo dois nós interagindo entre si, seja por associação física, ativação, inibição, co-regulação ou outra relação qualquer (BROWN et al., 2004; HUBER et al., 2007). Na Biologia de Sistemas, os grafos podem conter centenas de nós e, assim gerar grandes redes de componentes interagindo entre si. Apesar de o termo “grafo” estar associado com a representação matemática de dados, e o termo “redes” estar associado com a representação gráfica, ambos podem ser entendidos sinônimos (HUBER et al., 2007).

Figura 10. Representação dos componentes de um grafo. Nó (esquerda) pode ser a representação de proteínas, DNA, RNA e através de um conector (centro) pode formar interação (direita) com outro nó. Uma rede de interação pode possuir centenas de nós e ser organizada de analisada por cálculos matemáticos.

Outras abordagens matemáticas podem ser aplicadas após a formação das redes biológicas. Essas verificações fornecem dados sobre a disposição de cada nó dentro da rede, a relação entre os nós, além da identificação de sub-redes de interações contidas da rede geral (VALENTE et al., 2008). Um teste matemático bastante relevante na compreensão da rede é a análise de centralidade. Centralidades são caracteres matematicamente calculados para cada nó da rede que fornecem dados acerca da importância de cada componente individual dentro do sistema (KONIG e TESSONE, 2011). Uma das medidas importantes de centralidade, o degree (conectividade) representa o quanto um nó interage com outros nós dentro da rede. Nós com alto valor de degree são consideradas hubs e tendem a ser componentes importantes da arquitetura do sistema analisado (JIN et al., 2007; LIN et al., 2008). Outros parâmetros de centralidade bastante utilizados na Biologia de Sistemas são o closeness (proximidade) que indica o quanto um nó está próximo a outro, e o Betweenneess (intermedialidade) que representa o quanto um nó específico está entre todos os outros nós da rede (SCARDONI et al., 2009). Nós com altos valores de betweenneess são chamados de bottleneck (gargalos), pois interagem com diversos outros nós, tornando-se por vezes elos entre sub-redes diferentes, e cuja remoção fragmentaria a rede total (YU et al., 2007).

Dentro das redes, comumente formam-se estruturas onde os nós, mais relacionados entre si, formam maior número de interações. Essas estruturas são chamadas de sub-redes (ou clusters) e interagem com outras sub-redes para formar a rede total. Cada sub-rede pode ser formada por proteínas, genes, subunidades ou produtos metabólicos que compartilham atividade em processos biológicos específicos (ESTRADA e BODIN, 2008). Os processos biológicos contidos em cada rede podem ser avaliados independentemente em ferramentas denominadas Ontologias Gênicas (GO, do inglês Gene Ontology), e ordenados de maneira hierárquica em relação a rede total analisada. Os dados da GO fornecem informações importantes acerca do perfil celular obtido após determinadas condições-teste, e auxilia na elaboração de hipóteses e formulação de mecanismos celulares de ação (MAERE et al., 2005; RIVALS et al., 2007).

A complexidade das doenças inflamatórias, bem como o seu envolvimento na etiologia de doenças graves e de difícil tratamento como o câncer, apresentam-se como desafios para a pesquisa médica. O estudo de alternativas para a modulação da resposta inflamatória exige o conhecimento acerca das relações entre as proteínas e vias celulares, a fim de desenvolver métodos mais eficazes para a melhoria da qualidade de vida dos pacientes. Diante das novas atividades celulares atribuídas às proteínas de reparo de DNA e, frente à carência de estudos acerca do envolvimento da atividade de reparo da proteína APE1 na ativação da resposta inflamatória, este estudo visa analisar, pela primeira vez, o envolvimento da inibição da atividade de reparo de sítios AP pela MX na resposta inflamatória celular induzida por LPS.

2. OBJETIVOS