ESSAIS BIOLOGIQUES

Nous avons mené l’ensemble des expérimentations avec une angiosperme, le hêtre Fagus

sylvatica, connu pour sa faible résistance aux champignons. Les échantillons de bois ont été préparés

sous forme d’éprouvettes de dimensions 2,5 x 1,5 x 0,5 cm. Nous avons retenu une pourriture

blanche Coriolus versicolor du fait de la dégradation considérable qu’elle provoque en s’attaquant à

la lignine et aux polysaccharides du bois.

Avant imprégnation les éprouvettes de bois à traiter sont séchées 48 heures à l’étuve à une

température de 103°C puis maintenues à l’état anhydre jusqu’à l’imprégnation. La masse anhydre

avant traitement (m

) est déterminée en (g).

II.3.2. IMPREGNATION DES EPROUVETTES

Les éprouvettes sont placées dans une cloche à vide, munie d’un robinet à double voie. Six

éprouvettes sont placées dans un bêcher et recouvertes de billes de verre les empêchant de flotter lors

de l’injection de la solution. Les différents produits non miscibles à l’eau (propiconazole, Irganox

1076, Tinuvin 770) sont solubilisés dans l’éthanol aux concentrations indiquées dans la partie

résultats et discussion. Les formulations effectuées avec les différents tensioactifs antioxydants sont

réalisées dans l’eau. Une pression de 5 mbar est maintenue à l’intérieur de la cloche pendant 15

minutes. La connexion avec la pompe est ensuite fermée et la solution de traitement est alors

introduite par aspiration jusqu’à ce que les éprouvettes soient totalement recouvertes. Après retour à

la pression atmosphérique, l’ensemble est laissé à repos pendant deux heures, les éprouvettes sont

ensuite égouttées puis séchées à l’étuve jusqu’à ce que leur masse (m

) reste constante (environ 48

heures).

II.3.3. ESSAI BIOLOGIQUES SUR EPROUVETTES DE BOIS

II.3.3.1. Préparation du milieu

Un litre de milieu gélosé est préparé en additionnant 40 g de malt et 30 g d’agar dans un litre

d’eau distillée. Le mélange est chauffé à environ 100°C jusqu’à homogénéisation, le pH est ajusté à

4,8 à l’aide d’une solution d’acide chlorhydrique à 0,1 N. Puis la solution gélosée est stérilisée à

l’autoclave à 120°C pendant 25 minutes.

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Après refroidissement, sous la hotte préalablement nettoyée à l’éthanol et stérilisée aux UV, le milieu

gélosé stérilisé est coulé en petite quantité (environ 20 mL) dans des boites de Pétri de 8,5 cm de

diamètre à proximité d’une flamme. Après refroidissement et solidification du milieu, ce dernier est

inoculé en son centre avec un disque gélosé de mycélium fongique d’une culture âgée de 2 semaines.

Les boîtes sont laissées à incuber dans une enceinte climatique Binder KBF à 22°C et à 70 %

d’humidité relative jusqu’à ce que le mycélium recouvre totalement le milieu de culture (1 à 2

semaines).

II.3.3.2. Confrontation des éprouvettes au champignon

Les éprouvettes traitées ou non sortant de l’étuve et rapidement pesées (m

ou m

pour les

éprouvettes traitées ou non respectivement) sont placées dans des conditions stériles sur le milieu

gélosé recouvert de mycélium à raison de trois éprouvettes par boite. Elles sont ensuite laissées au

contact du champignon à 22°C et 70 % d’humidité relative pendant un temps variable pouvant

atteindre seize semaines. A l’issue de la période d’incubation, les éprouvettes sont retirées des boîtes

de Pétri et débarrassées du mycélium adhérent. Elles sont ensuite séchées jusqu’à obtention de leur

masse anhydre (m

). L’efficacité du traitement est estimée par la perte de masse en utilisant la

formule suivante :

Perte de masse = ((m

– m

) / m

) x 100

où m

est la masse sèche de l’éprouvette après la période d’incubation.

II.3.4. ESSAI D’INHIBITION DE CROISSANCE SUR MILIEU GELOSE

Le milieu de culture est préparé à partir de 20 g de malt et 40 g d’agar dissous dans un litre

d’eau distillée. Le mélange est alors chauffé à environ 70°C jusqu’à obtention d’une solution

homogène, puis le pH ajusté à 4,8 à l’acide d’une solution d’acide chlorhydrique 1 M puis stérilisé.

Après refroidissement, La solution gélosée encore tiède est réparti dans des fioles erlenmeyers de

100 mL préalablement stérilisées, dans lesquelles sont rajoutés les produits à tester solubilisés dans

le minimum d’eau ajoutés dans des conditions stériles (filtration à l’aide d’un filtre membranaire

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millipores de 0,45 µm). Les milieux de culture contenant les produits aux différentes concentrations

sont alors coulés en petite quantité (20 mL) dans des boites de pétri à proximité d’une flamme.

Après gélification du milieu, les boîtes sont inoculées avec le champignon d’essai et l’activité

inhibitrice des produits évaluée quotidiennement en mesurant l’évolution de la croissance du rayon

de la colonie et comparaison avec des boîtes témoins. Le pourcentage de croissance du champignon à

un moment t est calculé de la manière suivante :

% de croissance = (d / 8,5) x 100

où d correspond à la moyenne de deux mesures de diamètres de l’auréole de croissance du

champignon au moment t.

II.3.5. ESSAI SUR PAPIER FILTRE

Afin de vérifier si certains produits synthétisés possèdent des propriétés fongicides, des tests

d’inhibition de croissance de Coriolus versicolor ont été effectués. Pour cela, des disques de papier

ont été imprégnés des produits préparés à différentes concentrations, puis déposés sur un milieu

gélosé au centre duquel le champignon est inoculé. Chaque milieu contient deux disques traités et un

non traité. La cellulose utilisée est de type filtre Whatman. Les disques de cellulose mesurant 7 mm

de diamètre ont été sectionnés à l’aide d’un emporte pièce. L’ensemble est stérilisé à l’autoclave, les

celluloses sont ainsi placées dans un bocal enrobé de film d’aluminium.

Les disques sont disposés triangulairement trois par trois dans des boites de Pétri de 8,5 cm de

diamètre contenant un milieu malt agar et le champignon inoculé au centre de la boite. Chaque boite

contient un disque de papier non imprégné, échantillon servant comme témoin de virulence et deux

disques imbibés de 15 µL de produit à tester prélevés à la micro pipette puis déposés sur les disques

de cellulose. L’effet de chaque produit est estimé visuellement par des observations quotidiennes de

l’auréole de croissance du champignon dans les boites.