CARACTERISATION DES PROPRIETES ANTIOXYDANTES

L’activité antioxydante d’une substance peut se mesurer par sa capacité à inhiber l’oxydation

d’un système choisi comme référence. Nous utiliserons au cours de ce travail deux systèmes de

mesure différents. L’un est basé sur l’oxydation de l’acide linoléique, l’autre sur la vitesse de

transfert d’un atome d’hydrogène mobile de la substance à étudier à un radical libre, le

2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle ou DPPH.

II.2.2.1. Méthode expérimentale utilisant l’oxydation du linoléate de méthyle

a) Principe

Les acides gras polyinsaturés s’oxydent lentement à l’air et à température ambiante. La

réaction peut cependant être accélérée en augmentant la température et en utilisant un amorceur

radicalaire. Ce dernier facilite la chaîne d’oxydation.

Le dispositif expérimental est constitué de deux parties : la station de vide et de stockage de

l’oxygène d’une part et la partie réaction d’autre part. Les réactions d’oxydation ont lieu dans un

réacteur en pyrex à double enveloppe thermostaté. Un tube capillaire plonge dans le réacteur pour

assurer, par l’intermédiaire d’une pompe, l’agitation et la saturation en oxygène de la phase liquide.

Le réacteur est surmonté d’un réfrigérant à 4°C pour condenser le solvant. Le volume de la phase

liquide est de 4 cm

³

, celui de la phase gazeuse d’environ 100 cm

³

. La consommation d’oxygène est

suivie expérimentalement par la mesure de la pression surmontant le mélange réactionnel. Notons

que l’azote libéré par l’AIBN étant formé en très faible quantité, la pression mesurée est

pratiquement égale à celle de l’oxygène.

Le protocole expérimental utilisé au laboratoire concerne l’oxydation du linoléate de méthyle

(LH), amorcée par l’azobisisobutyronitrile (AIBN), le solvant étant le butan-1-ol et la température de

la réaction étant fixée à 60°C. L’effet de substances antioxydantes sur la réaction d’oxydation peut

être schématisé de la manière suivante (Figure 46) :

81

COOMe H _H (LH) N N NC CN ∆ (AIBN) CN 2 ^{+ N}2 A

En absence d'antioxydant :

AIBN 2A + N₂ A + O_{2 AOO} AOO + LH _{AOOH + L} L + O_{2 LOO} LOOH + L LOO + LH

Oxydation du substrat avec

consommation d'oxygène

( )

En présence d'antioxydant (φH) :

LOOH + L LOO + LH

Rupture de la chaîne d'oxydation

du substrat fonction du rapport

k

_II

/k

_I

LOOH +

φ

LOO +

φH

(I)

(II)

Figure 46. Effet de substances antioxydantes sur l’oxydation du linoléate de méthyle

Dans les deux cas (avec ou sans antioxydant) les réactions d’oxydation sont amorcées par la

décomposition de l’azobisisobutyronitrile, qui va entraîner la formation d’hydroperoxydes et par

l’oxydation du linoléate de méthyle, qui va assurer la propagation du processus d’oxydation avec

consommation d’oxygène. En présence d’antioxydant (φH), la réaction d’oxydation (I) se trouve en

compétition avec la réaction (II), qui, si le radical φ

.

_{formé est stable, va inhiber la réaction}

82

b) Conditions expérimentales de la mesure du pouvoir antioxydant en utilisant la méthode

au linoléate de méthyle

Dans un réacteur thermostaté sont introduits successivement 1 mL de butan-1-ol, dans lequel

sont solubilisés 4 équivalents de composé antioxydant (φH) à tester, 1 mL d’une solution de linoléate

de méthyle (LH) 0,4 M dans du butan-1-ol ou 2 mL d’estorob (mélange d’esters d’acides gras

insaturés contenant majoritairement du linoléate de méthyle à environ 75 %) et 2 mL d’une solution

d’AIBN (azobisisobutyronitrile) 9,3 mM dans du butan-1-ol. La réaction est laissée sous agitation

durant 3 heures à une température de 60°C sous une pression initiale de 150 Torrs. L’évolution de la

pression dans le réacteur au cours du temps est directement proportionnelle à la quantité d’oxygène

consommée au cours de la réaction. Les données sont enregistrées automatiquement par un système

informatisé doté d’un logiciel OXY BAR.

II.2.2.2. Méthode utilisant le DPPH

a) Principe

Une autre méthode de la mesure de l’activité antioxydante est l’étude de la réactivité des

composés en question avec un radical libre choisi. Un de ces radicaux est le DPPH

(2,2-diphényl-1-pycrylhydrazyle), commode à utiliser en raison de sa couleur violette (absorbance maximale vers 520

nm) et de sa disponibilité dans le commerce. La réaction de certains antioxydants avec le DPPH est

assez rapide et nécessite l’utilisation de la technique de l’écoulement bloqué (Stopped flow) dans

laquelle le mélange des réactifs est effectué en quelques millisecondes à l’entrée d’une cellule

d’analyse, ce qui permet l’étude des réactions de temps de demi-réaction aussi petits que 10 ms.

La réaction de phénols ou d’autres molécules donneuses d’un atome d’hydrogène avec le

DPPH est couramment utilisée pour évaluer le pouvoir antioxydant (ou antiradicalaire) de ces

molécules en solution homogène. On conçoit, effectivement, que la mesure de la constante de vitesse

de la réaction puisse constituer une estimation de la mobilité de l’atome d’hydrogène de ФOH

83

DPPH +

φ

OH DPPHH +

φ

O O₂N NO₂ O₂N N (C₆H₅)₂N (DPPH )

avec

Figure 47. Réaction entre les phénols et le radical DPPH

La cinétique des réactions du DPPH avec différents phénols ou extraits de bois a été

rapportée par Diouf (1999,2002) en utilisant la technique de l’écoulement bloqué, qui mélange

rapidement dans des temps inférieurs à 20 ms les réactifs dans une cellule permettant l’analyse par

absorption UV-visible ou par fluorescence.

L’évolution de la concentration du radical DPPH au cours du temps permet de quantifier le

pouvoir antioxydant des différents produits. Ce dernier est évalué en mesurant le temps de demi vie

(t

_1/2

), temps au bout duquel la moitié du radical DPPH initialement présent a disparu (Figure 48).

0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 2 0 4 0 6 0 T e m p s ( s e c ) A⁶ 2 0 n m to AD P P H + Ae x t r a i t s Ae x t r a i t s = c o n s t a n t e t1 / 2 + to

Figure 48. Détermination du temps de demi-réaction de la réaction du radical du DPPH avec

84

b) Conditions expérimentales de la mesure du pouvoir antioxydant en utilisant la méthode

au DPPH

Une solution de DPPH à 2.10

^-4

M et une autre contenant une dilution du composé à tester sont

placées dans les seringues du système de mesure. Ces solutions sont poussées par deux pistons

actionnés simultanément à la main vers l’entrée de la cellule d’observation photométrique où elles

sont rapidement mélangées. Le mélange est poussé par la suite vers la seringue d’arrêt. Pendant le

remplissage de la seringue d’arrêt, l’expérience est constamment répétée avec différentes dilutions.

Le mélange réactionnel reste constamment renouvelé dans la cellule d’observation et le temps zéro

de réaction correspond à l’arrêt brusque du fluide « Stopped flow ». Le schéma de l’appareillage est

représenté par la Figure 49.

La mesure de l’activité antioxydante des molécules étudiées se fait par détermination de la

concentration nécessaire pour atteindre un équilibre avec une consommation de 50 % en DPPH. Plus

la concentration nécessaire en composé phénolique pour atteindre cet équilibre est faible et plus

celui-ci est efficace.

Lumière Cellule d’analyse Seringue d’arrêt Poussoir Mélangeur B A

85

II.3. ESSAIS BIOLOGIQUES

Dans le document Tensioactifs antioxydants originaux pour la formulation de produits de préservation du bois (Page 95-100)