Escherichia coli

Escherichia coli fait partie de la famille des Enterobacteriaceae. Il s’agit de courts bâtonnets mobiles au moyen de flagelles péritriches, Gram négatifs, anaérobies facultatifs, non sporulés, oxydase négative, mesurant de 2 à 4 μm de long et d’un diamètre d’environ 0,6 μm. Ils sont capables de fermenter plusieurs sucres, mais leur fermentation du lactose avec production de gaz est caractéristique. La multiplication à 44°C (optimum 40°C et extrême à 45,5°C), la production d’indole et la présence d’une activité ß-glucuronidase, sont également caractéristiques. Les espèces d’E. coli sont sérotypées en se basant sur leurs 173 antigènes somatiques (O), 56 antigènes flagellaires (H) et 80 antigènes capsulaires (K) (Eslava et al., 2003). Etant l’espèce bactérienne anaérobie facultative prédominante dans l’intestin et les fèces, la présence d’E.

coli dans les aliments et l’eau est considérée comme une indication de contamination fécale et, dès lors, l’indication d’une possible présence de microorganismes pathogènes d’origine fécale. La surveillance d’E. coli représente le meilleur indicateur d’hygiène des procédés pour suivre la contamination fécale d’un aliment (UE, 2007), mais aucun critère de sécurité n’est pour le moment fixé dans la règlementation Européenne. La contamination a lieu le plus souvent lors de la production et de la transformation d’aliments crus d’origine animale, ou indirectement, via la contamination par de l’eau contaminée (Eslava et al., 2003). Dans les filières de production carnée, la principale source de contamination des denrées alimentaires par E. coli est le tractus intestinal des animaux. Leur présence indique un défaut de la technique d’abattage, ou une contamination croisée, mais peut également être due à une contamination par les personnes manipulant les denrées alimentaires.

disposé en grappe, non sporulé, coagulase positive. Cette espèce fait partie des bactéries aéroanaérobies facultatives, mais préférant le métabolisme aérobie.

C’est un germe mésophile, capable de se multiplier entre 4°C et 46°C, de manière optimale à 37°C, pour un pH allant de 5 à 9, avec un optimum de 7,2 à 7,6 et une aw de 0,86 en aérobiose et 0,90 en anaérobiose. C’est un germe halophile et xérophile car il se développe même en présence de sel et du sucre et survit dans les aliments déshydratés : sa croissance est possible jusqu’à une concentration de 18 % en sel en aérobiose (Bailly et al., 2012 ). Au total, 70-80

% des souches produisent des exotoxines (Cavalli, 2003). La toxinogénèse a lieu pendant la phase exponentielle de croissance, pour une température comprise entre 10°C et 45°C (avec un optimum de 40 à 45°C), un pH compris entre 5 et 8, une teneur en NaCl inférieure à 10%, une aw supérieure à 0,86 (Fosse et Margas, 2004). Staphylococcus aureus est un germe commensal de la flore cutanée des animaux et un agent possible de mammite chez les femelles en lactation (le plus souvent sub-clinique chez la vache, pouvant évoluer vers une forme gangréneuse chez la chèvre et la brebis) (Cavalli, 2003). Chez l’homme, il vit dans la cavité nasale, dans les glandes sébacées et sudoripares, dans les bulbes pileux. Le principal site pour les mains est le bout des doigts (en relation avec l’habitude de se gratter le nez). La contamination des viandes est donc possible au moment du dépeçage, de l’ablation de la mamelle et surtout chaque fois qu’il y a un contact direct entre l’homme et la carcasse. Les troubles (nausées, vomissements, diarrhées) peuvent apparaître chez les consommateurs après ingestion d’un aliment contenant les toxines. La dose minimale à ingérer pour provoquer les premiers symptômes reste mal définie. L’entérotoxine staphylococcique étant très stable à la chaleur, la simple cuisson reste inefficace pour assurer la destruction de la toxine et assainir en toute sécurité un produit de viande contaminé. Il va falloir éviter la contamination ou s’opposer à la multiplication du germe et à la sécrétion de la toxine en ne traversant pas la zone dangereuse (20°C- 50°C) ou en n’y résidant que fort peu de temps (ne jamais

3.1.5.2. Clostridium botulinium

Clostridium botulinum est un bacille Gram positif de 4 à 6 μ de longueur, aux extrémités arrondies, mobile (ciliature péritriche), anaérobie strict et sporulé.

Les souches de C. botulinum sont très hétérogènes d'après leurs caractères culturaux, biochimiques et génétiques et elles sont divisées en quatre groupes (I à IV). C’est une bactérie mésophile pouvant se multiplier significativement à 15°C (Fernandes, 2009). Les spores ont une résistance de 20 min à 110°C. Il est un agent d’intoxination et d’intoxication alimentaires humaine ou animale. Les toxines botuliniques se divisent en 7 types (A à G) selon leurs propriétés immunologiques, chacune étant neutralisée par un sérum spécifique. La toxine botulique est le poison le plus puissant qui existe. La toxine botulique A est la plus active. Le réservoir de C. botulinum, comme des autres Clostridium est l'environnement : sol, poussière, sédiments marins ou d'eau douce, eaux souillées, lisiers et occasionnellement le contenu digestif de l'homme et des animaux sains. L’homme ou l’animal s’infecte en ingérant d’aliment contaminé (notamment conserves et semi-conserve mal stérilisées, jambons crus secs, produits de boucherie et fourrages). La durée d’incubation est de 1 à 10 jours, le plus souvent 1 à 3 jours. La maladie se manifeste par des paralysies flasques (oculaires et cardio-respiratoires), des troubles digestifs (nausées, vomissements, diarrhées ou constipations dysphagie) et urinaires, un tarissement de toutes secrétions (et surtout des sécrétions salivaires). La maladie, plus ou moins grave, peut être mortelle en absence de traitement.

3.1.5.3. Clostridium perfringens

Clostridium perfringens appartient au groupe II du genre Clostridium et à la

50°C. Les spores thermosensibles de C. perfringens résistent 5 minutes à 100°C et produisent l’entérotoxine qui est responsable des intoxications alimentaires (Fosse et Margas, 2004). Le seuil au-dessus duquel il y a intoxication est 10⁵ ufc/g (AFSSA, 2006b). Ce germe ubiquiste est un hôte normal du tube digestif des animaux et de l’homme. La viande peut être contaminée au moment de l’éviscération si du contenu de l’intestin entre en contact avec la carcasse (Cavalli, 2003). L’homme se contamine en ingérant des aliments, notamment des produits carnés, contenant des bactéries. Les denrées incriminées sont les préparations à base de viande et en général cuites, conservées à l’abri de l’air (masses importantes, immersion dans un liquide, emballage étanche), refroidies lentement puis réchauffées lentement, ce qui favorise la multiplication des bactéries et la production de toxines (AFSSA, 2006b). Les symptômes apparaissent entre 6 et 24 h, généralement 10 à 12 h, après l’ingestion du repas contaminé. Ils se traduisent surtout par la diarrhée et de violents maux de ventre, parfois de nausées. Le plus souvent, cette affection guérit spontanément en 2-3 jours.

3.1.5.4. Salmonella

Les bactéries du genre Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae. Genre regroupant de petits bacilles, Gram négatif habituellement mobiles par des cils péritriches, mais des mutants immobiles peuvent exister et S. gallinarum est toujours immobile. Ces bactéries mesurent 0,7 à 1,5 μm de diamètre, pour 2 à 5 μm de longueur et sont aéro-anaérobies facultatives, oxydase négative et nitrate réductase positive. Elles sont mésophiles, capables de se développer à des températures comprises entre 5,2°C et 47°C (Fosse et Margas, 2004). Au sein de la sous espèce Salmonella enterica enterica, il existe plus de 2400 sérotypes différents parmi lesquels certains sont potentiellement pathogènes pour l’homme. Il s’agit de sérotypes ubiquistes qui peuvent être hébergés dans le tube digestif de l’homme, des animaux domestiques et sauvages, des animaux de compagnie et plus particulièrement

des volailles pour S. enteritidis. En ce qui concerne la viande bovine, S. dublin est également souvent incriminée. Cette dernière peut être hébergée dans le tube digestif des bovins et de l’homme. Les intoxications à salmonelles dues aux viandes sont sérieuses tant par le nombre de malades que par la gravité des symptômes. L’ingestion de 10¹ à 10¹¹ cellules de Salmonella peut déclencher une infection se manifestant par une fièvre à 39°C–40°C, des douleurs abdominales, des nausées, des vomissements et un syndrome diarrhéique caractérisé par des selles liquides et fétides (AFSSA, 2002). Salmonella non typhoïdienne provoque des abcès dans différents tissus, voire une septicémie.

Ces germes résistent au pH acide de l’estomac, entrent en compétition avec la flore normale de l’intestin grêle et franchissent la barrière épithéliale pour proliférer dans les plaques de Peyer et envahir les ganglions mésentériques (Hanes, 2003).

3.1.5.5. Escherichia coli

Les germes E. coli sont normalement présents parmi la microflore digestive de l’homme et de nombreux animaux à sang chaud, comme par exemple les bovins.

La plupart des E. coli sont sans danger pour l’homme et l’animal. Cependant, certaines souches sont pathogènes pour l’homme, à l’exemple de Escherichia coli entérohémorragiques ou EHEC (entero-hemorrhagic E. coli), dont la plus connue est E. coli O157:H7 et ayant un lien épidémiologique assez étroit avec le bœuf (Bailly et al., 2012). La principale maladie qu’elles provoquent chez l’homme est la colite hémorragique. Outre la colite hémorragique, les EHEC peuvent causer de la diarrhée, le syndrome hémolytique et urémique (SHU) principalement chez le jeune enfant ou le microangiopathie thrombotique

contaminée et insuffisamment cuite, mais peuvent également être dues à la consommation d’eau, de lait cru, de fruits, de légumes, à des baignades et à des contacts entre personnes (Feng, 2001).

3.2. Matériel et méthodes 3.2.1. Matériel

Le matériel utilisé dans la présente étude est constitué du matériel biologique, du matériel de prélèvement et de conservation et le matériel de laboratoire

 Matériel biologique

Le matériel biologique est constitué des échantillons de viandes prélevées sur des portions de carcasses du porc.

 Matériel de prélèvement

Le matériel pour le prélèvement des échantillons de viande est constitué essentiellement :

 d’une tenue vestimentaire adéquate (blouse, calot, bottes et tabliers blancs et propres);

 des manches de bistouris et des pinces à préhension réparties en jeux et des emporte- pièces d’une surface de coupe de 5 cm²;

 des lames de bistouris stériles à usage unique;

 d’un flacon d’alcool absolu à 99,9° pour aseptiser les instruments ;

 d’une boîte d’allumettes pour réaliser le flambage ;

 des sachets stomachers stériles où sont déposés aseptiquement les quantifier les échantillons et les milieux de culture, deux autoclaves, deux fours

pasteurs de marque Memmert et un bec bunsen, trois étuves de marque MEMMERT utilisées pour l’incubation des différents germes recherchés selon les conditions de températures adéquates, un bain-marie utilisé pour régénérer et aussi pour fondre les milieux de culture afin de les couler dans les boîtes de Pétri et les tubes à essai, anses de platine pour les ensemencements, un vortex utilisé pour homogénéiser le contenu des tubes, des verreries tels que des pipettes Pasteur, les pipettes graduées, des éprouvettes graduées, des boites de pétri, des flacons de 500 ml, utilisés pour réaliser les analyses microbiologiques. Les milieux de culture utilisés sont : Maximum Recovery Diluent (IVD CM0733), Nutrient Agar (IVD OXOID CM0003), Agar Bacteriological, (IVD OXOID CM0007), MacConkey Agar (IVD OXOID CM0007), Plate Count Agar (OXOID CM0325), Baird Parker Agar Base (OXOID CM0275), Violet Red Bile Agar (OXOID CM0107), Eau peptonée tamponnée (OXOID CM0509), Eau peptonée simple (OXOID CM0009), XLD Medium (OXOID CM0469), Salmonella Shigella Agar (OXOID CM0099).

3.2.2. Méthodes

3.2.2.1. Echantillonnage

L’analyse microbiologique a été réalisée sur des échantillons de viande provenant de 70 carcasses de porc. Les prélèvements ont été faits un jour par semaine pendant 7 semaines et conformément à la norme ISO 17604 (ISO, 2003). Le jour de l’échantillonnage a varié chaque semaine afin que les résultats soient représentatifs de toute la semaine (Tableau 2). Par jour de prélèvement, 10 échantillons ont été prélevés.

Tableau 2: Répartition des jours de travail et du nombre d’échantillon par semaine

Semaine Jour Nombre d’échantillon

1 Lundi 10

Conformément à la Décision 2001/471/CE du 8 Juin 2001 de la Commission des communautés Européennes, trois prélèvements d’une superficie de 25cm² au total ont été effectués par carcasse et sur dix carcasses, provenant de dix animaux différents. Les sites de prélèvement ont été: cou, cuisse, épaule. A l’aide d’un emporte-pièce de 3,5 cm de diamètre, d’une pince et d’une lame à usage unique montée sur un manche de bistouri, les échantillons ont été prélevés après habillage par la méthode d’excision (méthode destructive). Les 3 prélèvements ont été déposés de manière aseptique dans un sachet stomacher, refermé et déposé dans une glacière dont la température a été maintenue entre 0 et 4°C. Après le prélèvement, les échantillons ont été ramenés au laboratoire du Département de Production et Santé Animales de l’EPAC pour les analyses bactériologiques. Ces analyses ont été réalisées aussitôt après le prélèvement.

3.2.2.3. Préparation de la solution mère et des différentes dilutions

La préparation de la solution mère et des différentes dilutions a été faite conformément à la Décision 2001/471/CE du 8 Juin 2001. Les solutions mères ont été préparées en versant aseptiquement 100 ml d’eau peptonée tamponnée dans les sachets stomachers contenant chacun les trois prélèvements par carcasse. L'ensemble a été broyé pendant 2 à 3 min dans le stomacher. Le

1ml de la solution mère (10⁰) a été prélevé après homogénéisation et dilué au dixième dans 9 ml de Maximum Recovery Diluent. Cette solution a permis l’ensemencement à la dilution 10^-1 et la préparation de la dilution 10^-2 par dilution décimale. Pour obtenir la solution 10^-3, 1 ml de la solution 10^-3 a été ajouté à 9 ml de Maximum Recovery Diluent stérile.

3.2.2.4. Ensemencement des milieux de culture

L’ensemencement des milieux de culture a été immédiatement réalisé après chaque série de dilution et conformément à la norme ISO spécifique à chaque germe.

o FAM: ISO 4833, 2003;

o Salmonella: ISO 6579, 2002;

o Entérobactéries: ISO 21528-2, 2004.

o Staphylococcus aureus: ISO 6888-1, 1999 ; 3.2.2.5. Dénombrement bactérien

Le dénombrement a été fait sur des colonies bactériennes développées et conforme à la norme ISO spécifique à chaque germe. Les résultats ont été exprimés en log10 UFC/cm² de surface de carcasse prélevée pour les recherches quantitatives et en absence ou présence de germes pour les recherches qualitatives. Le nombre N de micro-organismes présents dans l'échantillon pour essai, en tant que la moyenne pondérée à partir de deux dilutions successives a été calculé à l'aide de la formule :

Pour obtenir le nombre D de micro-organismes présents dans l'échantillon pour essai par cm² de surface de la carcasse, il a été appliqué la formule suivante :

Avec:

N= nombre d’Unité Formant Colonie obtenu par millilitre de l’échantillon, V= Volume de la solution initiale ;

S= Surface totale de l’échantillon.

Les résultats ont été affectés aux critères d’appréciations suivants : satisfaisant, acceptable, et non satisfaisant conformément au Règlement N°2073/2005 de l’Union Européenne (Tableau 3)

S

V

D  N *

Tableau 3: Critères d’interprétation des résultats des contrôles microbiologiques

Porcins

Germes Interpretation Limite Méthode

de

Le logiciel Statistical Analysis System (SAS, 1991) a été utilisé pour les analyses statistiques. La moyenne et la déviation standard de la FAM et des

3.3. Résultats et discussions

La moyenne des échantillons prélevés ainsi que la moyenne générale minimale et maximale de tous les échantillons analysés des Unités Formant Colonie (UFC) dénombrées par carcasse échantillonnée et exprimées en log10, sont présentées dans le tableau 4

Les résultats des analyses sont récapitulés dans le tableau 4.

Tableau 4: Qualité microbiologique des échantillons analysés

FAMT :Flore Aérobie Mésophile Totale , Moy :Moyenne , ES :Erreur Standard , Min :Minimum , Max :Maximum ,

Il ressort de l’analyse de ce tableau que la FAM a varié de 5,4 à 6,1log UFC/cm² pour l’ensemble des échantillons, soit une charge moyenne totale de 5,8log UFC/cm². En comparant ces résultats aux normes fixées par le règlement (CE) n^o 2073/2005 de la commission du 15 novembre 2005, on constate que la concentration moyenne en FAM (5,81log UFC/cm²) est supérieure au maximum (5log UFC/ cm²) donc non satisfaisant. Ce taux de contamination élevés pourrait être dû au cadre de travail car les tueries étant à l’aire libre les carcasses

compris entre le minimal et le maximal exigé pour les entérobactéries la viande est donc peu satisfaisante. La présence des entérobactéries sur la carcasse témoigne des mauvaises conditions d’hygiène et particulièrement de contaminations fécales. Ces défauts d’hygiène sont certainement survenus lors de l’éviscération qui est une opération délicate car la masse des réservoirs digestifs est telle que les déchirures ou les perforations sont fréquentes et permettent au contenu de venir souiller la carcasse, les outils et les mains des opérateurs (Boudry et al., 2002).

Les staphylococcus présentent une variation de 0 à 2,2log UFC/cm ² avec une charge moyenne de 1,1log UFC/cm². La présence de ces germes pourrait s’expliquer par les contaminations résultantes de la manipulation des carcasses par des personnes souffrantes d’infections à staphylocoques avec des lésions au niveau des mains telles que les abcès et panaris.

L’absence de Salmonella sp sur les échantillons analysés dans le cadre de cette étude suppose que ces échantillons répondent à la norme exigée. Toutefois si l’échantillonnage a été réalisé sur un effectif plus important (au moins 1000 sujet) cela nous renseignerais d’avantage. Une étude sur le portage des salmonelles pourrait aider à mieux cerner le statut des sujets abattus sur ces aires d’abattages vis-à-vis de ce germe.

Au regard des résultats obtenus, pour garantir la sécurité sanitaire des consommateurs de cette viande fraiche il serait nécessaire d’accordé une attention particulière aux différents techniques de cuissons des viandes. En effet pour la forme de préparation qui utilise l’eau il faudrait un temps raisonnable de cuissons. Pour ce qui concerne la forme braiser il faudrait s’assurer que toutes les parties aient reçu une quantité suffisante de chaleur pour détruire

Conclusion et suggestions

Le présent stage de fin de formation en licence professionnelle nous a permis de développer des compétences en matière d’inspection sanitaire des viandes et en analyse bactériologique. Ce stage nous a permis également d’évaluer la flore microbienne de surface des carcasses des porcs abattus sur les aires d’abattages de Godomey et d’Abomey-Calavi. A l’issu de cette étude, nous avons remarqué que la charge microbienne en FAM, en entérobactérie, en staphylococcus est supérieure à la norme recommandée. Aucune présence de salmonella n’a été observée. De façon générale, ces résultats dénotent une mauvaise hygiène des procédés d’abattage. Au regard de ces observations nous pouvons suggérer les recommandations ci-après :

 La sensibilisation des bouchers et charcutiers sur les risques qu’ils font courir à la population en matière de santé

 Le renforcement du système d’hygiène au niveau des aires d’abattages et surtout sur les procédés d’abattage.

 L’élargissement des analyses bactériologiques sur les autres espèces

 L’accélération de la construction de la nouvelle aire d’abattage de Houèdo financé par le projet PAFILAV.

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