Endocytose de tétraspanines

Douze tétraspanines possèdent au niveau C-terminal le motif YXXϴ (x représentant tout type de résidu et ϴ un résidu hydrophobe) [306]. Ce motif est considéré comme un potentiel site d’endocytose dépendant de la clathrine, via une interaction avec la protéine adaptatrice AP2, et de redirection vers les lysosomes depuis le réseau trans-golgien [256].

Chez CD63, il s’agit de la séquence GYEVM, qui permet l’interaction avec les sous unités µ2, µ4, µ3A et µ3B des adaptateurs et permet son ciblage dans les endosomes tardifs [307]. Cette tétraspanine, qui est entre autres connue pour être fortement endocytée, peut faciliter l’internalisation de certains de ses partenaires, comme le récepteur aux chimiokines CXCR4 [308], la glycoprotéine PMEL17, impliquée dans la mélanogenèse [309], la synaptotagmine VII, un senseur de calcium qui est envoyé aux lysosomes [310], ou encore la sous-unité β de la pompe H+K+-ATPase [154]. Nous pouvons aussi citer un cas chez la drosophile, où la tétraspanine Tsp42Ej « Sun » [311], proche de la CD63 mammalienne, présente en abondance

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dans la rétine, contrôle l’endocytose de la rhodopsine (Rh1), qui est internalisée par voie clathrine- et arrestine-dépendante puis dégradée dans les lysosomes.

Dans une série d’études, la tétraspanine CD82 a été décrite comme facilitant, lorsqu’elle est fortement exprimée et via un changement de compartimentation, l’endocytose de son partenaire EGFR suite à la fixation de son ligand [312]. Cependant un autre laboratoire a plus récemment démontré que la suppression de cette tétraspanine augmente l’internalisation de l’EGFR et induit une baisse de ses niveaux totaux et de surface [313], décrivant alors un rôle de stabilisateur pour CD82, opposé à celui précédemment décrit. Ceci suggère que l’effet de CD82 sur l’EGFR peut varier selon le contexte cellulaire.

Dans les neurones, une étude a démontré que Tspan7 joue un rôle dans la stabilisation du récepteur de l’AMPA [314]. Son extinction augmente l’endocytose de la sous-unité GluA2 de l’AMPAR, et tous deux interagissant avec le régulateur d’endocytose de protéines synaptiques PICK1, il a été suggéré que Tspan7 et PICK1 étaient en compétition pour la régulation du trafic de l’AMPAR, le premier le stabilisant à la surface et le second, induisant son endocytose.

Enfin, notons que les tétraspanines sont présentes en quantité sur les vésicules extracellulaires tels que les exosomes (CD63, CD81…) et peuvent en moduler la composition et le comportement. Par exemple, CD9 et CD82 permettent le recrutement aux exosomes de la β-caténine, élément essentiel de la signalisation Wnt et E-cadhérine [315]. CD9 serait notamment important pour la formation de certaines vésicules extracellulaires, son extinction dans des cellules dendritiques réduisant le nombre d’exosomes produits [315]. Enfin, il a été suggéré que Tspan8 (CO-029) faciliterait le recrutement, dans des lignées cancéreuses, d’autres tétraspanines et de certaines intégrines aux exosomes [316].

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Objectifs et hypothèses

de travail

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Objectifs et hypothèses de travail

Au sein de la famille des tétraspanines, le groupe des TspanC8 (Tspan5, 10, 14, 15, 17 et 33) se distingue par leur capacité à s’associer à la métalloprotéase ADAM10. Des résultats publiés précédemment par le laboratoire montrent que toutes les TspanC8 promeuvent la sortie d’ADAM10 du réticulum endoplasmique, et que deux d’entre elles (Tspan10 et 17) la dirigent vers les endosomes tardifs alors que les quatre autres (Tspan5, 15, 14 et 33) induisent son expression à la membrane plasmique. Ces dernières confèrent à ADAM10 une sélectivité de substrats différente, notamment sur la signalisation Notch pour laquelle Tspan5 et Tspan14 sont des régulateurs positifs alors que Tspan15 en est un régulateur négatif. Les mécanismes sous-tendant cette dualité de fonctions sont encore mal compris. Il a été notamment proposé que cela puisse être dû à un changement de conformation d’ADAM10 ou à une compartimentation membranaire différente.

Cette thèse a pour vocation de contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dichotomie des régulations de fonctions d’ADAM10 par les TspanC8. Le premier objectif de mon travail a été de déterminer si et comment les TspanC8 affectent le trafic d’ADAM10. A cet égard, différents protocoles expérimentaux ont été mis au point, permettant de mesurer l’internalisation d’ADAM10 et d’étudier sa localisation subcellulaire. De tels protocoles permettent d’étudier les mécanismes d’endocytose d’ADAM10 ainsi que son devenir. De plus, la validation expérimentale d’une régulation différentielle du trafic par les TspanC8 permet de tester le rôle de leurs LEL et extrémités N- et C- terminales dans la modulation de l’expression, du trafic et de la fonction d’ADAM10.

La génération par le laboratoire d’un anticorps anti-Tspan5 et la disponibilité d’un anticorps anti-Tspan15 permettent de tester la validité de modèles de TspanC8 couplés aux tags GFP ou myc et de travailler sur les versions endogènes de ces deux TspanC8. Grâce à ces anticorps, le second objectif de ma thèse était d’approfondir l’étude de la relation entre les couples Tspan5 / ADAM10 et Tspan15 / ADAM10 et de tester l’hypothèse d’une compétition entre eux. ADAM10 est également impliqué dans plusieurs pathologies, ce qui renforce l’intérêt de la découverte d’un régulateur fin de sa fonction. Considérant ces éléments, le dernier objectif de ma thèse a consisté à tester l’impact de l’anticorps anti-ADAM10 11G2 sur le trafic et la fonction d’ADAM10 et d’en analyser les mécanismes sous-jacents.

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Matériel et méthodes

Anticorps, plasmides et mutagenèses

Les anticorps de souris dirigés contre les versions humaines d’ADAM10 (11G2), CD9 (TS9), CD81 (TS81), CD63 (TS63) et Tspan5 (TS5-2 et TS5-1r) ainsi que les anticorps dirigés contre Tspan15 (5F4, IgG2b ; et 5D4, IgG1) ont été générés dans notre laboratoire [102], [183], [227].. L’anticorps anti-cadhérine provient de BD transduction. L’anticorps polyclonal dirigé contre le domaine cytoplasmique d’APP nous a été donné par le Dr. W. Annaert. Le marquage des anticorps avec les fluorophores DyLight 650 ou 550 ont été réalisés au laboratoire en utilisant des esthers de succimidine et en suivant les indications du fournisseur, Thermo Scientific.

Les plasmides codants pour Tspan5 et Tspan15 fusionnés à une GFP ont été décrits dans un article du laboratoire publié en 2012 [230]. Après une amplification par PCR, les inserts ont été sous-clonés dans le vecteur pCDNA3/hygro (Thermo). Les chimères entre Tspan5 et Tspan15 ont été réalisées au laboratoire. Les échanges des chimères ont été réalisés au niveau des résidus conservés entre Tspan5 et 15. Ts15LEL5, pour laquelle la LEL de Tspan15 a été remplacée par celle de Tspan5, ainsi que sa construction réciproque (Ts5LEL15), ont été décrites dans l’article Saint-Pol et al. publié en 2017 [227]. Les séquences des sites échangés au niveau de l’extrémité N-terminale sont les suivantes : Séquences C-terminales : Tspan5- ALLQIFGVLLTLL -Tspan15 pour T5C15 ; Tspan15- LLPQFLGICLAQN -Tspan5 pour T15C5 ; et séquences N-terminales : Tspan15- FSYLWLKYFIFGF -Tspan5 pour T5NC15 ; Tspan5- PEVSCCIKFSLII -Tspan15 pour T15NC5 (en gras, l’acide aminé conservé entre les deux tétraspanines).

Culture cellulaire et génération des cellules sur- ou sous- exprimant ADAM10 ou des tétraspanines.

Les cellules murines OP9, qu’elles expriment ou pas le ligand de Notch DLL-1 (OP9-DLL1) [317] ont été cultivées dans du milieu alphaMEM suppléé de 10% de SVF et des antibiotiques

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(PSN). Les cellules humaines, qu’il s’agisse de la lignée d’ostéosarcome U2OS [318] exprimant Notch1, de la lignée de cancer de la prostate PC3, ou de la lignée HeLa, ont été cultivées dans le milieu DMEM suppléé de 10% de SVF et de ces mêmes antibiotiques. Ces lignées cellulaires ont vu leurs niveaux d’ARN messagers codant pour les TspanC8 quantifiés [219], [230]. Les lignées cellulaires dérivées des U2OS et exprimant les transgènes de TspanC8 couplés à la GFP ont été également décrites dans ces mêmes études.

Les transfections ont été réalisées grâce à l’agent de transfection Fugene HD (Promega). Les cellules exprimant stablement les différentes constructions ont été sélectionnées par un traitement à l’hygromycine et le tri des cellules a été réalisé sur un trieur Beckton Dickinson FACS Aria à l’aide d’un marquage avec les anticorps anti-Tspan5 (TS5-2) ou Tspan15 (5D4, IgG1).

Les cellules PC3 pour lesquelles l’expression de Tspan5, Tspan14 ou ADAM10 a été éteinte ont été générées grâce à la technologie d’édition de gènes CRISPR/Cas9. Pour ADAM10, nous avons utilisé la séquence précédemment publiée TGCTCCTCTCCTGGGCGGCG [8] et les séquences cibles pour Tspan5 et Tspan15, respectivement TCTTCCATCACCGATCTCGG et CAGAAAAAGTTCAAGTGCTG, ont été sélectionnées grâce à l’outil mis à disposition en ligne par le Broad Institute ( https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design). Les ADN guides correspondant ont été clonés dans les plasmides lentiCRISPRv2 (Addgene #52961) selon les instructions du laboratoire Zhang ( http://www.genome-engineering.org/gecko/) (Ran et al. 2013). Ces plasmides ont été transfectés de la même manière que ceux décrits dans le paragraphe ci-dessus, et les cellules ont été traitées avec de la puromycine à 5 µg/ml, deux jours après leur transfection, et ce pendant 48 heures. Les cellules ayant perdu l’expression du gène d’intérêt ont également été triées comme décrit ci-dessus.

Extinction de l’expression de protéines par SiRNA

Une solution de transfection est préparée en amont, contenant par puits de plaque à 6 puits : 5 µL d’INTERFERin stock (Polyplus) pour une concentration finale de 10 nM, 2 µL d’oligos à 5µM et 194 µL de milieu DMEM sans sérum ayant été incubée 20 minutes à 20°C. Les cellules U2OS sont ensuite ajoutées dans les puits à la concentration de 200 000 cellules par puits pour un volume final de 1 mL. Les oligos utilisés ciblent les séquences suivantes :

Page | 82 • SiDyn2 GACAUGAUCCUGCAGUUCA [320] • SiCHC GCAAUGAGCUGUUUGAAGA

[320]

Analyse de l’activité Notch Luciférase

Cette analyse a été réalisé comme décrit dans l’étude de Moretti et al. en 2010 [318]. Les cellules U2OS-N1 ont été cultivées à 25 000 cellules par cm². 24 heures après, ces cellules ont été transfectées avec les plasmides codant pour le rapporteur CSL et la Renilla

comme indiqué ci-dessus. Après 24 heures, les cellules U2OS ont été mises en co-culture avec des OP9 ou OP9-DLL1 à la concentration de 35 000 cellules par cm². Les

activités de la firefly ou de la Renilla ont été déterminées en utilisant le test Dual luciferase reporter assay de Promega selon leurs indications. Les analyses statistiques ont par la suite été réalisées grâce à un test Anova suivit d’un test de comparaison multiple de Dunett.

Immunoprécipitation et Western Blot

Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse (30 mM de Tris à pH 7.4, 150 mM de NaCl, 1mM de O-phénantroline et des inhibiteurs de protéases) auquel ont été ajoutés soit 1% de Brij 97 ou 1% de Triton X100. Dans certaines expériences, l’inhibiteur d’ADAM10 Gi254023X a été ajouté à la concentration de 5 µM au tampon de lyse. Après 30 minutes d’incubation à 4°C, les composants insolubles ont été éliminés par une centrifugation à 10 000 g et les protéines ont été immunoprécipitées par 10 µL de billes de sépharose couplées à de la protéine G ainsi qu’avec 1µg d’anticorps ou 0,4 µl d’ascite pour 400 à 800 µL de lysat. Les protéines ainsi immunoprécipitées ont été séparées par électrophorèse en conditions non réductrices sur un gel de polyacrylamide contenant du SDS et transférées sur une membrane de PVDF (GE helthcare). Le Western-Blot sur les lysats a été réalisé grâce aux anticorps primaires appropriés et des anticorps secondaires couplés à une Alexa 680. Dans le cas des immunoprécipitations, lors des révélations, pour ne pas être gêné par les immunoglobulines utilisées lors de la précipitation, des anticorps spécifiques couplés à la biotine et un anticorps

Figure 25 – Schéma du mécanisme

Notch-Luciférase

Selon Moretti et al. 2010 [318], schéma par J. Saint-Pol.

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secondaire anti-biotine couplé à une Alexa 680, à l’exception des anti-Tspan15 et anti-CD81. Enfin, toutes les acquisitions ont été réalisées grâce à un scanner de type Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Bioscience).

Immunofluorescence sur lame

Les cellules ont été cultivées sur des lamelles de verre dans du milieu complet puis fixées durant 15 minutes avec 4% de paraformaldéhyde à température ambiante. Elles ont ensuite été lavées en PBS, puis incubées durant 20 minutes dans 50 mM de NH4Cl en PBS. Pour le marquage de surface, les cellules ont été incubées directement durant 30 minutes / 1 heure avec les anticorps (primaires comme secondaires) à la concentration de 10-20 µg/ml, dans du PBS suppléé de 0,1% de BSA à température ambiante. Pour le marquage intracellulaire, les cellules ont été incubées avec 0,1% de saponine en présence de l’anticorps. Les lamelles contenant les cellules ont été montées en utilisant du ProLongTM Diamond Gold (Invitrogen). Enfin, ces montages ont été observés soit à l’aide du microscope à fluorescence Leica DMR équipé de la caméra CoolSnap HQ2 (Photometrics) contrôlée grâce au logiciel Metamorph (Molecular devices), soit à l’aide du microscope confocal Leica SP5, avec un objectif 63x, une ouverture numérique de 1.4 et un zoom de 3x ou de 6x.

Analyse de l’expression membranaire par cytométrie en flux

Les cellules ont été détachées avec de la Trypsine-EDTA, lavées deux fois en milieu complet (DMEM) et incubées pendant 1 heure à 4°C avec l’anticorps primaire. Après trois lavages, les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4°C avec un anticorps secondaire (anti-souris) couplé à de la phycoérythrine. Les cellules ont été analysées grâce à un cytomètre de type Accuri C6 (Beckton-Dickinson).

Mesure de l’endocytose par cytométrie en flux

Les cellules ont été incubées à 37°C avec de l’anticorps anti-ADAM10 11G2 couplé à du Dylight 650 à 10 µg/ml sur différents temps. Après leur décrochage à l’accutase, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire couplé à du PE (phycoérythrine) durant 30 minutes à 4°C, et leur fluorescence a été mesurée par cytométrie en flux sur un BD Accuri C6. Pour chaque expérience, une fraction des cellules n’a pas été incubée avec l’anticorps primaire

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à 37°C mais à 4°C, avec le même marquage secondaire en PE, déterminant ainsi le marquage membranaire après fixation. Cela permet de déterminer le ratio de fluorescence PE / Dylight 650 lorsque l’anticorps n’est présent qu’à la surface de la cellule. En supposant que ce ratio est constant, il permet à partir de la fluorescence PE d’estimer la quantité d’anticorps couplé au Dylight 650 présent à la surface cellulaire et donc d’estimer la fraction internalisée d’ADAM10 (FL4i) selon la formule suivante, où FL20 ou FL2n et FL40 ou FL4n sont les valeurs de PE et de Dylight 650 pour les cellules traitées durant n heures ou non traitées (temps 0).

𝐹𝐿4_𝑖 = 𝐹𝐿4_𝑛− (𝐹𝐿2_𝑛×^𝐹𝐿40 𝐹𝐿2₀)

Figure 26 – Protocole expérimental pour la quantification de l’internalisation d’ADAM10 par cytométrie en flux

Les cellules sont incubées à 37°C avec un anticorps fluorescent puis la fraction de surface est révélée avec un anticorps secondaire d’une autre couleur à 4°C après décrochage des cellules avant d’être analysées au cytomètre.

Mesure de l’endocytose au microscope confocal

Les cellules ont été incubées durant 1 heure à 37°C en présence de l’anticorps anti-ADAM10 11G2 couplé à du Dylight 650 (ci-après nommé « marquage total »). Après fixation ou refroidissement à 4°C, la fraction d’ADAM10 à la surface de la cellule est marquée grâce à un anticorps polyclonal anti-souris couplé à de l’Alexa Fluor 568 ou 488 (ci-après nommé « marquage de surface »). Les images ont été obtenues au microscope confocal Leica SP5 (objectif 63x, ouverture numérique 1.4, airy = 1, et zoom 3x), grâce à un empilement d’acquisitions réalisées tous les 250 nm sur l’axe vertical des cellules.

La quantification de ces images et l’établissement du pourcentage d’internalisation a été réalisé sur le logiciel Icy imaging (Chaumont et al., 2012, http://icy.bioimageanalysis.org), selon un protocole (Figure 28) mis au point au laboratoire. Ce protocole utilise le marquage

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externe comme masque afin d’isoler la fraction internalisée de l’anticorps, qui est ensuite quantifiée puis comparée à la fraction totale de ce même anticorps, permettant alors d’en déduire un ratio interne / externe. Ce protocole est décrit plus précisément dans le paragraphe suivant.

Les deux canaux de couleur sont extraits. Les valeurs du canal contenant le marquage externe (R dans la figure Figure 28) subissent une addition de 1 pour ne pas être égales à zéro. Ces valeurs sont utilisées pour créer, par division du marquage total (V), un ratio pixel à pixel dont les valeurs basses correspondent aux pixels de surface et les valeurs élevées aux pixels internes. Un seuil appliqué à ce ratio permet d’éliminer le marquage externe, laissant uniquement les pixels internalisés. La valeur initiale de ces derniers leur est ensuite réattribuée par multiplication, et un flou gaussien est appliqué à l’image afin d’éliminer les pixels uniques, permettant d’homogénéiser le bruit de fond. Enfin, le module Spot detector

est utilisé afin d’identifier les groupements de pixels pouvant correspondre aux vésicules internalisées et éventuellement afin de supprimer les marquages aberrants qui seraient encore présents. La somme du marquage de ces vésicule est comparée au marquage total dont le bruit de fond a été homogénéisé par un flou gaussien et éliminé par un seuil de type Kmean. Le ratio entre ces deux images correspond alors à la fraction d’anticorps internalisée par les cellules.

Dans certaines expériences, les cellules sont incubées avec des anticorps non marqués. Dans ces cas, la fraction totale est révélée après le marquage de la fraction de surface grâce à un anticorps anti-souris polyclonal couplé à un fluorochrome (Alexa Fluor 647) en présence de saponine. La quantification dans le logiciel Icy est alors réalisée comme précédemment expliqué, et une valeur indicative d’endocytose est alors obtenue en divisant la valeur de la fraction interne par la fraction externe.

Analyse du clivage protéique

Les cellules ont été traitées ou non avec du DAPT à 3µM avant d’être lysées directement dans du tampon de Laemmli pour une analyse en Western-Blot comme décrit ci-dessus. Pour chaque protéine analysée, l’intensité de la bande correspondant au CTF (C-terminal fragment) a été mesurée grâce à Fiji puis normalisée sur la quantité de protéines non clivées. Les résultats sont ensuite exprimés en pourcentages de production de CTF par rapport à ceux observés dans les échantillons contrôles.

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Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel Graphpad Prism sur des expériences indépendantes en se basant sur des tests Anova à une ou deux passes suivies par des tests de comparaison mutliples de Dunnett. Les diagrammes en barres représentés montrent la moyenne +/- la SEM sous forme de barres d’erreurs.

Figure 27 – Protocole expérimental d’internalisation d’ADAM10 pour analyse en microscopie confocale

Les cellules sont incubées soit avec un anticorps fluorescent (A), soit avec un anticorps non fluorescent (B) qui est par la suite révélé par un anticorps secondaire fluorescent pouvant accéder à la fraction internalisée grâce à une perméabilisation des membranes. La fraction de surface est révélée avec un anticorps secondaire d’une autre couleur permettant de discriminer le marquage interne du marquage externe.

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Figure 28 – Protocole de quantification des images sur Icy

Un ratio pixel à pixel est établi en divisant plan par plan les images issues du marquage total (V) par celles issues du marquage de surface (R). Un seuil est ensuite appliqué déterminant le ratio discriminant la fraction internalisée, ensuite quantifiée grâce au plugin spot detector. Les marquages totaux et de surface sont quantifiés après suppression du bruit de fond grâce à un seuil de type K-mean. Le pourcentage de l’anticorps internalisé est alors obtenu en divisant les valeurs de la fraction interne par celles de la fraction totale. Images rondes : représentation des valeurs des pixels servant aux opérations mathématiques ou aux sélections. Images carrées : résultats comprenant les valeurs des pixels d’origine.

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Résultats

Etude de l’internalisation d’ADAM10

La métalloprotéase ADAM10 est régulée par les tétraspanines TspanC8. Une précédente publication du laboratoire a démontré que les Tspan5 et Tspan15 régulent la compartimentation d’ADAM10 à la surface de la cellule, affectant ses interactions et sa fonction. Par ailleurs, une transfection par ces deux TspanC8 couplées à la GFP induit, dans les cellules U2OS, une augmentation du niveau de surface d’ADAM10, respectivement d’un facteur 3 et 5 [219]. Dans la mesure où les tétraspanines transfectées sont en large excès, ces différences d’expression devaient probablement être le reflet de différences de trafic après la sortie du RE. Dans ce contexte, une hypothèse serait que cette différence d’expression serait due une variation de l’internalisation d’ADAM10 selon la TspanC8 à laquelle il s’associe. Afin d’établir un test fiable et de caractériser l’endocytose d’ADAM10, j’ai tout d’abord concentré mon travail sur l’étude de son internalisation endogène dans les cellules U2OS transduites par le récepteur Notch1. Cette lignée a été choisie comme modèle pour l’étude de l’endocytose d’ADAM10 dans la mesure où elle est par ailleurs un modèle de référence pour l’étude de la