enChIP

Le protocole enChIP a été réalisé selon la méthode décrite par Fujita et Fujii (Fujita and Fujii, 2015, 2016). Elle consiste en l’étude des interactions moléculaires sur des

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séquences génomiques spécifiques par une approche combinant les techniques de CRISPR et de ChIP. Un ARN guide ciblant une région d’intérêt est couplé à une Cas9 inactive par modification génétique (dCas9) et fusionnée à une étiquette FLAG. Par une approche de ChIP, la séquence d’intérêt est immunoprécipitée grâce à l’anticorps FLAG et les interactions génomiques avec la séquence peuvent être étudiées.

2.10.1 Conception des ARN guides

Afin de mettre au point la technique, les ARN guides ont été dessinés de façon à cibler des séquences promotrices dont les interactions moléculaires sont bien caractérisées, soit le promoteur 1a de Gata4 et le promoteur du gène Star. Dans le but d’obtenir des ARN guides adéquats ciblant notre séquence d’intérêt, certains points majeurs doivent être pris en compte. Tout d’abord, les amorces choisies doivent avoir une séquence d’environ 19-20 nucléotides et doivent être adjacentes au motif nucléotidique NGG, appelé séquence PAM. Ces ARN guides doivent cibler une séquence située à environ 200 paires de bases en amont de l’exon 1. Également, les amorces doivent être spécifiques à la séquence cible, en plus d’être dans l’orientation adéquate pour cibler adéquatement la séquence. Les amorces ont été générées à l’aide du logiciel en ligne accessible au http://crispr.mit.edu. Les amorces ayant la plus haute spécificité et le moins de séquences cibles hors région ont été choisies (Tableau 2.6). Par la suite, les amorces complémentaires simples brins ont été appariées par incubation à 95°C pour 5 minutes. Ces ADN doubles brins ont été ligaturés dans un vecteur spcas9_puc19 à l’aide du site de restriction BsmbI.

2.10.2 Analyse de l’efficacité des guides

Afin de vérifier que les guides ciblent bien la séquence d’intérêt, des transfections ont été effectuées en combinant les guides avec un vecteur hCas9 clivant l’ADN. Les transfections ont été effectuées en nombre de copies égales entre les guides et le vecteur hCas9. L’ADN génomique a été extrait des cellules à l’aide de la trousse Accustart mouse genotyping kit. L’ADN a ensuite été amplifié par PCR en utilisant les oligonucléotides décrits au tableau 2.7. Les produits amplifiés ont été appariés selon la méthode décrite par Zhu (Zhu et al., 2014). 8 µl des produits PCR, 2 µl de tampon NEBuffer 2 10X et 10 µl d’eau selon les conditions décrites au tableau 2.8. Les produits

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appariés ont été déposés sur gel de polyacrylamide (1 mL TBE, bisacrylamide, APS, Temed) et migrés à 150 V pendant 2 heures.

Tableau 2.6 : Séquences des ARNguides utilisés pour cibler le promoteur 1a de

Gata4 et le promoteur Star.

Tableau 2.7 : Oligonucléotides utilisés pour la validation des séquences ciblées des ARN guides par amplification PCR.

Tableau 2.8 : Paramètres PCR utilisés pour l’appariement des séquences ciblées par l’ARN guide.

Cibles de l’ARN guide Oligonucléotides sens/antisens

promoteur 1a Gata4 5’-ACACCGCGGAGGTGCTGCCGGGTCCG-3’

5’-AAAACGGACCCGGCAGCACCTCCGCG-3’

promoteur Star 5’-ACACCGGAGGGAGCAGACTGTGTAAG-3’

5’-AAAACTTACACAGTCTGCTCCCTCCG-3’

Cibles de l’ARN guide Oligonucléotides sens/antisens

promoteur 1a Gata4 5’-GACTGGCCTAAGGGAGTCACG-3’

5’-AGGTCACCTTCTCCTCTACCAG-3’

promoteur Star 5’-GCACCTCAGTTACTGGGCAT-3’

5’-ACACAGCTTGAACGTAGCGA-3’

Étapes Température Temps

1. Dénaturation initiale 95°C 5 minutes

2. Hybridation 95°C-85°C -2°C/seconde

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2.10.3 Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)

Une quantité de 1 x 106 _{cellules MA-10 a été ensemencée dans des pétris 60 mm. Les}

guides ont été transfectés avec le vecteur dCas9_Flagx3 en nombre de copies égales. Au moment de récolter les cellules, celles-ci sont soumises à des liaisons transversales entre les protéines et l’ADN par l’addition de PFA 1% pour 10 minutes à 37°C. L’arrêt de la réaction se fait ensuite par l’ajout de glycine pour 10 minutes à température ambiante. Les cellules sont rincées 2 fois avec du PBS IX froid puis récoltées. Elles sont ensuite lysées par l’ajout de 2 tampons successifs (tampon 1 : 0,25% Triton X- 100, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES pH 6,5 ; tampon 2 : 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES pH 6,5). Le culot est mis en solution dans 200 µl de tampon de sonication (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0) et soumis à une sonication de 250 secondes afin d’obtenir des fragments d’ADN d’environ 200-1000 paires de bases. Les extraits sont ensuite incubés 1 heure en présence de 5 µg d’anticorps IgG souris, puis pendant la nuit en présence de 5 µg d’anticorps Flag M2 (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) et de 40 µl de billes magnétiques couplées à la protéine G (Invitrogen, Burlington, Canada). Les billes sont ensuite lavées avec une succession de tampons pour 10 minutes chaque (tampon 1 : 20 mM Tris-HCL pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS ; tampon 2 : 20 mM Tris-HCL pH 8,0, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS ; tampon 3 : 10 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,25 M LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% desoxycholate de sodium). Les complexes ADN/Protéines- billes sont ensuite séparés en incubant à 37 °C 10 minutes en présence d’un peptide FLAG. Un traitement d’une heure à la RNase A et à la protéinase K est effectué et les échantillons sont ensuite purifiés sur colonne Qiagen suivant le protocole du manufacturier.

2.10.4 Vérification de l’efficacité du ChIP

Une réaction qPCR avec des amorces spécifiques pour la région du promoteur d’intérêt est réalisée. Ces réactions permettent de quantifier les segments d’ADN qui ont été précipités avec le complexe. Les séquences de ces amorces se retrouvent au tableau 2.9. Chacune des paires d’amorces a été utilisée en tant que témoin négatif pour l’autre séquence non ciblée. Une fois les données du qPCR obtenues, le pourcentage (%)

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d’immunoprécipitation (IP) est calculé, faisant référence à l’efficacité à immunoprécipiter la protéine d’intérêt. Le % IP a été normalisé par rapport à un locus non ciblé par la protéine dCas9.

Tableau 2.9 : Oligonucléotides utilisés pour la validation des séquences cibles des ARN guides par qPCR

Cibles de l’ARN guide Oligonucléotides sens/antisens

promoteur 1a Gata4 5’-CAGAAAACCGGCGCGATCT-3’

5’-CAGCGCAGGCGATCGCTAC-3’

promoteur Star 5’-GGGAAGCATTTAAGGCAGCG-3’

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