ELISA classiques

Les ELISA sont les outils de diagnostic privilégiés du fait de leur rapidité, sensibilité, reproductibilité et prix peu coûteux. Trois différentes techniques sont utilisées couramment : l’ELISA de compétition qui

85 cible tous les isotypes d’anticorps, l’ELISA indirect révélant uniquement les IgG et l’ELISA de capture ou MAC ELISA ((MAC) ELISA pour IgM Antibody-Capture ELISA) mettant en évidence les IgM (figure 28, b). Des kits de diagnostic prêts à l’emploi sont commercialisés en médecine humaine et vétérinaire.

Les ELISA IgG indirects nécessitent l’utilisation d’un anticorps secondaire anti-espèce [226, 266] (figure 28, b). Du fait de la grande variété des hôtes potentiels à WNV, les laboratoires de diagnostic vétérinaire ont graduellement remplacé les ELISA IgG indirects par les ELISA de compétition qui permettent à priori de tester les échantillons issus de toutes les espèces animales [139]. Cette polyvalence provient du fait que les anticorps présents dans le sérum entrent en compétition avec les anticorps monoclonaux anti-WNV pour la fixation au site antigénique. Les ELISA de compétition sont les plus sensibles de toutes les techniques décrites ci-dessus.

Des essais inter-laboratoires récents et impliquant des laboratoires de référence européens, du Moyen-Orient, d’Afrique et d’Amérique ont souligné les points faibles des techniques sérologiques actuellement utilisées [267] : des réactions croisées entre les anticorps dirigés contre le WNV et les anticorps dirigés contre des flavivirus du même groupe antigénique comme les virus JEV, TBEV ou USUV sont fréquemment mises en évidence, en particulier dans les tests ELISA indirects IgG, de compétition et dans une moindre mesure pour la détection des IgM par MAC-ELISA.

Du fait de leur rapidité et faible coût, les ELISA de compétition sont donc plus appropriés aux enquêtes sérologiques. Tout résultat positif nécessitera le recours à la méthode de référence, le test de neutralisation virale, long et laborieux, pour identifier le flavivirus en cause [17] (manuscrit N°1). Les MAC-ELISA sont utiles pour détecter les infections aiguës (8–60 jours après l’infection) chez les humains et les chevaux. Néanmoins chez l’homme, les IgM peuvent persister jusqu’à un an dans 20 à 50% des cas et gêner le diagnostic d’infection aiguë [224]. Cependant les MAC-ELISA apportent des informations essentielles pour un diagnostic d’infection aiguë à WNV car :

 _{La présence d’IgM contre le WNV dans le LCR est un diagnostic de certitude pour l’infection}

du SNC, ces anticorps ne traversant pas en temps normal la BHE.

 Ils sont moins sujets aux réactions croisées que les ELISA IgG indirects ou de compétition [225, 267].

 La réponse IgM positive signe une infection aiguë à WNV plutôt qu’une vaccination. La bibliographie à ce sujet est cependant contradictoire avec certains articles considérant qu’il n’y a pas de réponse IgM induite après vaccination quel que soit le vaccin utilisé (vaccin inactivé ou vaccin recombinant canarypox) [268] alors que des réponses IgM positives

86 peuvent être détectées dans les premiers jours après vaccination avec le vaccin inactivé Duvaxyn® WNV dans d’autres études [269].

87 A)

SNT (PRNT/Micro-VNT)

HIT IFI ELISA

Principe Les anticorps neutralisent l’attachement du virus à la cellule, l’endocytose et/ou la fusion membranaire

Inhibition par les anticorps de l’agrégation érythrocytaire induite par le virus

Les anticorps reconnaissent les cellules infectées par le virus et fixées sur une lame de microscope ; ils sont mis en évidence par un anticorps-anti-espèce conjugué à un fluorochrome

ELISA indirect : les anticorps reconnaissent l’antigène viral fixé sur la plaque et sont révélés avec un anticorps anti-espèce lié à une enzyme (Autres ELISA : cf b) Cible de l’anticorps Epitopes neutralisants sur la protéine E

Protéine E Virus entier Virus entier, lysat de virus ou protéines recombinantes (prM-E, NS1, E-DIII…) Interprétation Protection des cellules en présence d’anticorps neutralisants Inhibition de l’Hémaglutination en présence des anticorps présents dans le sérum Fluorescence de cellules infectées par le virus en présence d’anticorps dans le sérum

Réaction colorimétrique avec l’intensité de la coloration en rapport avec la concentration en anticorps

Avantages - Standard - Très spécifique - Pas limitée à une espèce animale

- Peu cher - Méthode de dépistage (quelques heures)

- Pas limitée à une espèce animale - Laboratoire de confinement P3 non nécessaire une fois que l’antigène a été produit - Rapide (1-2 jours) - Kits commerciaux disponibles - Possibilité de différencier les IgG et IgM

- Laboratoire de confinement P3 non nécessaire une fois que l’antigène a été inactivé

- Rapide (quelques heures) et peu cher - Méthode intéressante pour le dépistage

- Kits commerciaux disponibles - Distinction des IgG et IgM - ELISA de compétition : pas limitée à une espèce animale

- Laboratoire P3 non nécessaire avec antigènes inactivés et recombinants

Inconvénients - Moins sensible que l’ELISA

- Réactions

sérologiques croisées limitées au sein d’un même sérocomplexe (JEV par exemple) - Méthode longue (3-7 jours)

- Nécessite un laboratoire de confinement P3 - IgM et IgG non différenciées

- Moins sensible que l’ELISA - Moins spécifique que la SNT : réactions croisées dans le sérocomplexe JEV et avec les autres sérocomplexes des flavivirus - Présence d’inhibiteurs non spécifiques - IgM et IgG non différenciées

- Moins spécifique que la SNT : réactions croisées dans le sérocomplexe JEV et avec les autres sérocomplexes des

flavivirus (en particulier pour

les IFA mettant en évidence les IgG)

- Moins spécifique que la SNT : réactions croisées dans le sérocomplexe JEV et avec les autres sérocomplexes des flavivirus (en particulier pour ELISA IgG indirect et de compétition)

Applications sur le terrain

Confirmation d’infections passées

Enquête sérologique Investigation de cas cliniques ELISA IgG indirect et de compétition : investigation de cas cliniques, enquête sérologique, certification lors du transport

MAC-ELISA: confirmation d’une infection récente ; certification lors du transport + - + - + -

88

(B)

Figure 28: (A) Principaux tests sérologiques utilisés pour le diagnostic des flavivirus (B) Principe de trois différentes méthodes d’ELISA

(les chiffres représentent les différentes étapes de la méthode) [17].