II. Validation des méthodes d'électrotransfert et caractéristiques d'expression obtenues 105
II.3. Electrotransfert intra-oculaire 120
L'œil est un organe difficile à traiter, du fait de la difficulté d'atteindre l'intérieur de l'organe, et du manque d'efficacité des traitements classiques reposant pour la plupart sur des instillations. Ces dernières années ont vu le développement de l'électrotransfert intra-oculaire. Pour le moment les cellules cibles sont principalement les cellules rétiniennes317,376,377, les cellules de la cornée316,378,379 ou de la conjonctive380.
Nous pensions que des cellules cibles intéressantes seraient non neuronales, faciles à atteindre, avec un fort potentiel de transfectabilité et de longévité. Nous avons donc choisi d'évaluer la faisabilité de l'électrotransfert des myofibres du muscle ciliaire, qui n'est pas un muscle squelettique mais un muscle lisse.
II.3.1
Efficacité de la méthode et localisation de l'expression du transgène
Afin de contrôler qu'il y a bien expression du transgène après électrotransfert, et de visualiser la localisation de cette expression, nous avons utilisé le gène rapporteur GFP, et effectué des coupes immunohistochimiques (travaux réalisés par l'équipe de Francine Behar-Cohen, INSERM U598, Paris). 3µg de plasmide pEGFP-C1 ont été injectés dans le muscle ciliaire du rat, ou ont été injectés et suivis d'un électrotransfert. Les prélèvements ont été effectués huit jours après les injections. Les coupes permettaient de visualiser la localisation de la protéine GFP, et la réalisationd'immunomarquage au DAPI permettait de visualiser les noyaux cellulaires. Un immunomarquage a aussi été effectué pour révéler l'actine des fibres musculaires lisses (anti-α-sm-1).
Nous avons ainsi observé un signal GFP très net dans les deux types de fibres du muscle ciliaire : les fibres longitudinales et circulaires. Cette fluorescence était colocalisée avec l'immunomarquage anti- actine des fibres musculaires lisses. L'électrotransfert réalisé permettait donc d'obtenir une transfection cellulaire efficace, et celle-ci était bien localisée au niveau du muscle ciliaire.
Les coupes réalisées en contre coloration hématoxyline-éosine montraient qu'il n'y a pas de dommages liés à la procédure d'électrotransfert, 8 jours après sa réalisation. Une légère infiltration cellulaire était observée au niveau du site d'injection. L'examen clinique des yeux le jour de l'électrotransfert ou 8 jours après n'a pas permis d'observer des signes d'inflammation ou de brûlure liés aux impulsions électriques.
La méthode ainsi réalisée semble efficace et sûre.
Figure 32 : Exemple de sections frontales antérieures de la région ciliaire. A : Histologie hématoxyline-éosine des fibres circulaires du muscle ciliaire. B : Immunochimie de la GFP (vert). Les noyaux sont colorés en bleu au DAPI.
C : Immunohistochimie de l'actine des fibres musculaires du muscle ciliaire (rouge). Les noyaux sont colorés en bleu au DAPI.
D : Colocalisation de l'actine des fibres musculaires (rouge) et de la GFP (vert) mettant en évidence la localisation de la GFP dans les fibres du muscle ciliaire. Les noyaux sont colorés en bleu au DAPI.
II.3.2
Etude cinétique
Un suivi cinétique de l'expression dans le muscle ciliaire a été réalisé en utilisant le gène rapporteur luciférase, à la dose de 3µg. L'œil controlatéral recevait une injection seule de 3µg de pVAX2 luc. L'expression a été suivie pendant un mois et les résultats sont présentés sur la figure 33.
La détection de luciférase dans le muscle ciliaire, dosée ex vivo dans les lysats de muscle ciliaire, à l'aide d'un luminomètre, était maximale à la première mesure effectuée, soit 5 jours après
Résultats
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électrotransfert. Elle décroissait ensuite jusqu'au 22ème jour après électrotransfert, et semblait se
stabiliser entre le 22ème et le 30ème jour après électrotransfert. Cependant une étude à plus long terme
serait nécessaire pour confirmer l'obtention d'un "pallier" de production de protéine, ou vérifier si la décroissance protéique est simplement ralentie.
Figure 33 : Cinétique d'expression luciférase après électrotransfert dans le muscle ciliaire de 3µg de plasmide pVAX2 luc. Les mesures ont été réalisée 6, 12, 22, et 30 jours après électrotransfert, sur des lysats de muscle ciliaire, à l'aide d'un luminomètre. (moyenne + SEM, n=5).
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 5 10 15 20 25 30
jours après électrotransfert
cp
s
injection seule
injection + électrotransfert
II.3.3
Expression de hTNFR-Is
La méthode d'électrotransfert dans le muscle ciliaire étant réalisable, nous nous sommes intéressés à la capacité de sécrétion des fibres musculaires transfectées dans l'humeur aqueuse (HA). Dans ce but, le muscle ciliaire était injecté avec 30µg de plasmide pVAX2 hTNFR-Is/mIgG1 suivi ou non d'un électrotransfert. Sept jours après les injections, l'humeur aqueuse et le sérum des animaux étaient prélevés.
Nous avons ainsi obtenu une expression moyenne de hTNFR-Is de 274 ± 39 pg/mL pour les animaux traités par injection seule de 30µg de plasmide pVAX2 hTNFR-Is/mIgG1, et de 691 ± 121 pg/mL pour les animaux traités par injection suivie d'un électrotransfert de la même dose de plasmide. Le taux de hTNFR-Is détecté dans l'humeur aqueuse des yeux controlatéraux non traités était considéré inférieur au seuil de détection du kit utilisé (15 ± 11 pg/mL). Aucun hTNFR-Is n'a été détecté dans l'humeur aqueuse des yeux naïfs (moyenne + SEM, n=6/groupe).
Nous avons aussi évalué le taux circulant de hTNFR-Is qui était, dans tous les groupes, inférieur au seuil de détection du dosage ELISA utilisé. Il n'y a donc pas de diffusion significative de la protéine transgénique.
Le muscle ciliaire est par conséquent capable de sécréter la protéine de fusion hTNFR-Is/mIgG1. L'injection seule de plasmide permet une expression non négligeable de protéine, mais l'électrotransfert permet d'obtenir des taux assez élevés (691 ± 121 pg/mL), qui pourraient être intéressants pour une approche thérapeutique.