Approches systémiques 171

Notre première approche s'est fondée sur l'utilisation de l'électrotransfert intramusculaire afin d'obtenir la sécrétion de la protéine thérapeutique, et son action systémique sur les articulations touchées par la maladie. Cette approche avait déjà été utilisée avec succès au laboratoire à l'aide d'un plasmide codant l'IL-10354. Une première expérience réalisée à la dose de 15µg de plasmide thérapeutique a mis en évidence l'intérêt de l'électrotransfert puisqu'une simple injection du plasmide pCOR hTNFR- Is/mIgG1 ne permettait pas d'inhiber les signes cliniques de la maladie.

Les résultats obtenus par électrotransfert de 50µg de plasmide codant la protéine chimérique hTNFR- Is/mIgG1 montrent qu'un unique traitement, à l'apparition des signes cliniques de la maladie, permettait d'obtenir une inhibition très nette des signes cliniques et histologiques dans un modèle expérimental de polyarthrite rhumatoïde. L'effet protecteur était observé à long terme sur plus de cinq semaines.

L'électrotransfert de la même dose de plasmide codant la forme dimérique de hTNFR-Is permettait une inhibition modérée, mais néanmoins statistiquement significative, des signes cliniques de la maladie, mais était sans effet sur les signes histologiques. La légère décroissance des scores cliniques était observée à partir de deux à trois semaines après électrotransfert ; or à cette date, les taux sériques de protéine dimérique avaient chuté. Des études réalisées avec des splénocytes infectés par un rétrovirus codant pour le monomère TNFR-Is, ont mis en évidence que l’évolution de la maladie ne corrélait pas avec le taux sérique de protéine, mais avec le taux local articulaire389,390_{. Ceci}

pourrait expliquer l’effet thérapeutique du dimère malgré son faible taux sérique. Nous pouvons par ailleurs supposer que l'utilisation d'une dose plus élevée de plasmide permettrait une meilleure prévention du développement de la maladie.

La forme monomérique ne permettait pas quant à elle d'inhiber la progression de l'arthrite, ceci peut s'expliquer par son instabilité sérique, et sa faible affinité envers le TNF-α. Des taux très élevés de protéine circulante sont donc nécessaires pour obtenir un effet thérapeutique. Ainsi, les essais de phase clinique I réalisés avec la protéine recombinante onercept se basent sur une dose de 50 mg de protéine injectée par voie sous-cutanée tous les deux jours, et l'efficacité thérapeutique de cette dose n'a pas encore été contrôlée.

Diverses approches de thérapie génique systémique ont été utilisées dans des modèles animaux de PR, tels que l'arthrite expérimentale au collagène chez la souris, les souris transgéniques pour le

Discussion

TNF-α, l'arthrite induite par des parois de streptocoques chez le rat, ou encore l'arthrite induite par des antigènes chez le lapin. Ces études montraient qu’il est possible de traiter l’inflammation articulaire par transfert du gène du TNFRs. Ainsi, un vecteur adénoviral codant la protéine de fusion TNFR-Is/mIgG1 injecté lors de l'apparition des signes cliniques chez la souris permettait une amélioration de l’AEC pendant 10 jours, mais une forte augmentation des scores arthritiques était observée les 10 jours suivants, tandis que la protéine était toujours détectée dans le sérum. La même observation a été effectuée par cette équipe après administration d’une protéine recombinante TNFR-Is/IgG1368. L'hypothèse émise pour expliquer cette efficacité uniquement à court terme est l'obtention d'une réponse immune contre la protéine transgénique, entraînant la production d'anticorps anti-TNFR-Is qui exerceraient un effet agoniste au TNF-α en se liant aux récepteurs membranaires. D’autres travaux, utilisant une construction adénovirale similaire, mais dans l’arthrite au collagène chez le rat, ont montré l’efficacité de la protéine obtenue par injection intraveineuse de l’adénovirus avant ou après le début de la maladie, mais cette équipe n’a observé aucun effet thérapeutique par injection intra- articulaire431_.

Simultanément à nos travaux, deux équipes ont étudié l'efficacité d'approches anti-TNF-α par électrotransfert intramusculaire. Kim et al355 ont ainsi montré l'efficacité, pendant au moins 18 jours, d'un plasmide codant une protéine fusionnée hTNFR-IIs/hIgG1et administré par électrotransfert à l'apparition des signes cliniques de la maladie, sur les scores cliniques et histologiques de l'arthrite expérimentale au collagène. Le traitement par électrotransfert d'un plasmide codant une forme dimérique du hTNFR-IIs avec un espaceur polyglycine permettait une légère inhibition des signes cliniques de la maladie sur treize jours385, sans que la protéine ne soit détectée dans le sérum. Ces résultats sont en accord avec nos observations, et confirment la supériorité de la forme fusionnée du récepteur soluble du TNF-α pour le traitement de la PR par approche systémique.

Nous avons réalisé un contrôle positif de l'inhibition du développement de la maladie par injections répétées de protéine recombinante etanercept. Lorsque les injections étaient réalisées trois fois par semaine, à la dose de 200µg, les animaux étaient très efficacement protégés de la maladie ; par contre, les scores cliniques augmentaient dès que les injections étaient espacées (deux/semaine). L'arrêt complet des injections entraînait une rapide augmentation des scores cliniques des animaux ; ils devenaient supérieurs à ceux observés par un unique électrotransfert de plasmide pVAX2 hTNFR- Is/mIgG1 cinq semaines auparavant. Ces résultats sont en accord avec les observations réalisées chez des patients atteints de PR placés sous traitement par etanercept, chez qui l'arrêt du traitement conduit au retour immédiat des symptômes de la maladie432.

Par ailleurs, l'observation de scores cliniques stables mais plus élevés chez les animaux électrotransférés par le plasmide codant la forme chimérique hTNFR-Is/mIgG1, comparés à ceux traités par etanercept, est sans doute liée au délai nécessaire entre l'électrotransfert et l'obtention, dans la circulation, d'un taux suffisant de protéine thérapeutique. En effet, les résultats obtenus par l'étude cinétique montrent que deux semaines sont nécessaires pour atteindre le taux maximal de protéine sécrétée. Les scores cliniques se stabilisent dès six jours après électrotransfert, ce qui suggère que le taux de protéine chimérique permettant d'inhiber la progression de la maladie est atteint en quelques jours (≈5ng/mL). Ce taux correspond à la valeur stable de protéine obtenue à long terme, ce qui peut laisser supposer un effet thérapeutique possible à très long terme par cette approche.

Les résultats obtenus illustrent la potentialité d'une approche par thérapie génique systémique pour le traitement de la PR. Cette approche permet une sécrétion continue et à long terme de la protéine à un taux thérapeutique. Par cette méthode, les taux circulants de protéine thérapeutique sont d'environ 5 à 10 ng/mL chez la souris, valeurs nettement inférieures aux 200µg d'etanercept utilisés en injections

bihebdomadaires. Ces faibles taux circulant devraient donc garantir l'absence de tout effet secondaire systémique.

L'utilisation de la lignée cellulaire DBA/Tst/hTNFR-Is/mIgG1 dans le modèle de l'arthrite expérimentale au collagène n'a pu être réalisée pour des raisons de temps. Cependant, les temps circulants de protéine transgénique étaient encore de l'ordre de 1ng/mL trois semaines après la greffe de 8.106 cellules, ce qui s'est avéré être un taux circulant efficace par électrotransfert du plasmide codant la forme fusionnée hTNFR-Is/mIgG1 dans le même modèle de pathologie. Cette étude a donc toutes les chances de donner des résultats intéressants.