Effets du traitement de la 5’AZA sur la tumorigénèse des souris leucémiques

Seul le modèle leucémique est utilisé pour étudier l’évolution de la leucémie en présence d’un traitement à la 5’Azacytidine. Le choix du traitement des souris a été effectué après avoir testé différentes drogues in vitro. Seule la molécule 5’Azacytidine a montré une efficacité et une différence de comportement entre les différentes lignées. (Voir partie IV-A)

109 Figure 45 : Etude de la survie des souris syngéniques C3H et nudes traitées à la 5’Azacytidine vs un

contrôle au PBS injectée avec des cellules exprimant la protéine p65/RelA WT, la protéine mutée p65/RelA D361E, les fragments p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549. (A) Etude de la survie des

souris syngéniques traitées à la 5’Azacytidine vs souris contrôle en présence de l’expression de p65/RelA WT (10 souris/groupe). (B) Etude de la survie des souris syngéniques traitées à la 5’Azacytidine vs souris contrôle en présence de l’expression de p65/RelA D361E (10 souris/groupe). (C) Etude de la survie des souris syngéniques traitées à la 5’Azacytidine vs souris contrôle en présence de l’expression des deux fragments p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 (10 souris/groupe). (D) Etude de la survie des souris nudes traitées à la 5’Azacytidine vs souris contrôle en présence de l’expression de p65/RelA WT (8 souris/groupe). (E) Etude de la survie des souris nudes traitées à la 5’Azacytidine vs souris contrôle en présence de l’expression de p65/RelA D361E (8 souris/groupe). (F) Etude de la survie des souris nudes traitées à la 5’Azacytidine vs souris contrôle en présence de l’expression des deux fragments p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 (8 souris/groupe).

1) Souris syngéniques

Les souris sont traitées à l’agent déméthylant 5’Azacytidine à J7. Pour chacun des groupes p65/RelA WT, p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549, le traitement provoque une mortalité des souris plus rapide qu’en absence de traitement (Figure 45 A, B, C). Pour les groupes p65/RelA WT traité ou non, la survie est plus longue, en absence de traitement, prolongée d’une quarantaine de jours (Figure 45A). L’évolution clinique est aussi plus rapide chez les souris p65/RelA D361E non traitées vs celles traitées (Figure 45B). Mais cette différence de survie est moins marquée que chez les souris injectées avec les cellules leucémiques p65/RelA WT. Quant aux groupes de souris p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362- 549 traité ou non, ils présentent une évolution de la survie dans le temps similaire (Figure 45C). Néanmoins, les souris non traitées survivent plus longtemps. Donc le fait de traiter les souris à l’agent déméthylant 5’Azacytidine ne permet pas de prolonger la durée de vie des souris en ralentissant la progression de la leucémie. Au contraire, en tant qu’agent déméthylant, la 5’Azacytidine doit déméthyler des régions d’ADN enclenchant une expression plus importante de gènes oncogènes accélérant le développement de la maladie. De plus, la 5’Azacytidine peut également suractiver le système immunitaire ou comme dans le cas de la cytarabine, induire une action protectrice du transfert de mitochondries des cellules stromales vers les cellules leucémiques (Moschoi R. et al. 2016) entraînant une mort plus rapide des souris.

2) Souris "nude"

Les souris "nudes" sont également traitées à l’agent déméthylant 5’Azacytidine à J7. Chez les souris "nudes" injectées avec des cellules exprimant p65/RelA WT, le traitement n’apporte aucun bénéfice en terme de survie puisque celle-ci est identique pour les traitées

110 comme les non traitées (Figure 45D). Par contre, les souris nude du groupe p65/RelA D361E ont une durée de survie prolongée d’une dizaine de jours (Figure 45E). De même, le groupe p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 survivent plus longtemps en présence du traitement (Figure 45F). Ainsi, les souris de ces deux groupes traitées à la 5’Azacytidine présentent une survie prolongée de plusieurs jours par rapport à celles non traitées. Donc, dans ce modèle murin dépourvu de cellules T, on observe bien de façon générale une efficacité de traitement permettant une prolongation de la vie de la souris et une inhibition de l’évolution de la maladie.

3) Bilan du développement tumoral sous traitement

Tableau 2 : Bilan du développement tumoral en présence d’un agent déméthylant 5’AZA dans

les modèles syngénique et nude.

Lorsque les souris syngéniques sont traitées avec l’agent déméthylant 5’AZA, le développement tumoral est plus précoce qu’en absence de traitement. Au contraire, les souris nudes traitées avec la 5’AZA survivent plus longtemps qu’en absence de traitement (Tableau 2).

Le traitement à la 5’Azacytidine doit donc enclencher une réponse immunitaire anormalement élevée causant une mort plus rapide des souris. Il existe donc une incidence du système immunitaire sur la capacité de la 5’Azacytidine à diminuer la tumorigénèse dans ce modèle murin (Tableau 2). Il peut également s’agir comme lors du traitement avec la cytarabine une action protectrice du transfert de mitochondries des cellules stromales vers les cellules leucémiques lors du trainement avec la 5’Azacytidine (Moschoi R. et al., 2016).

CTRL 5'AZA CTRL 5'AZA

p65/RelA WT + +++ +++ +

p65/RelA D361E + +++ +++ +

p65/RelA N&C Ter + +++ +++ +

syngénique

111

III) Etude du rôle fonctionnel de p65/RelA et des différents

mutants

Pour comprendre les effets in vivo, nous avons mené différentes études comme la prolifération et le cycle cellulaire in vitro

Figure 46 : Design de l’étude du rôle fonctionnel

de p65/RelA et des différents mutants dans les différentes lignées leucémiques exprimant soit le

plasmide Vide soit p65/RelA WT soit p65/RelA D361E soit p65/RelA 1-361 soit p65/RelA 362- 549 soit p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549.

A) Prolifération

Figure 47 : Etude la prolifération des différentes lignées leucémiques exprimant soit le plasmide Vide soit p65/RelA WT soit p65/RelA D361E soit p65/RelA 1-361 soit p65/RelA 362-549 soit p65/RelA 1- 361 + p65/RelA 362-549 (n=1).

p65/RelA joue un rôle dans la prolifération des cellules leucémiques. Nous avons voulu déterminer l’influence de nos constructions sur la prolifération. Avec un changement régulier de milieu, les cellules prolifèrent de la même façon. Nous n’observons pas de modifications de prolifération quelle que soit la construction utilisée (Figure 47). La tumorigénèse plus élevée de p65/RelA D361E ne s’explique pas par une prolifération plus rapide.

112

B) Cycle cellulaire

Figure 48 : Etude du cycle cellulaire des lignées leucémiques DA1-3b exprimant p65/RelA WT,

p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549. (A) Mesure du cycle cellulaire à J0 des

différentes lignées. (B) Mesure du cycle cellulaire à J2 (48H) des différentes lignées. La phase G1/G0 correspond à la phase de préparation à la duplication du matériel génétique (une copie de l’ADN = n). La phase S correspond à la phase de réplication de l’ADN menant au passage d’une copie à deux copies de l’ADN = n à 2n). La phase G2 correspond à la phase de préparation à la division cellulaire : la mitose (deux copies de l’ADN = 2n). Les barres d’erreurs correspondent aux SEM.

Le cycle cellulaire est étudié chez les 3 lignées majeures caractéristiques des phénomènes pouvant être observés chez les patients à J0 et au bout de 48h de prolifération. A J0 comme au bout de 48H, la majorité des cellules sont en phase G1. Les cellules se répartissent en proportion relativement égale entre les phases S et G2 à J0. Mais, au bout de 48H, les proportions changent : davantage des cellules se trouvent en phase S.

A J0, les 3 lignées présentent une phase G1 quasiment identique (65% vs 63% vs 66% pour les lignées p65/RelA WT, p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 respectivement). On n’observe pas de différence significative entre les 3 lignées (Figure 48A). De même, la proportion de cellules en phase S est équivalente pour l’ensemble des trois lignées (18%). Le taux de cellules en phase G2 est similaire pour les trois lignées (15% vs 18% vs 14% pour les lignées p65/RelA WT, p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 respectivement). Ces très faibles différences sont non significatives (Figure 48A).

Ces proportions dans les différentes phases changent pour chacune des lignées au bout de 48H (Figure 48B). Au bout de 48H, le nombre de cellules en phase G1 est plus faible qu’à J0 (de l’ordre de 50% vs 60%). Néanmoins, la lignée p65/RelA WT garde la plus forte proportion de cellules (57%) en phase G1. A l’inverse, les lignées p65/RelA D361E et p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 sont présentes en plus faible proportion (55%). En phase S, davantage de cellules (27%) de la lignée p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 sont en phase S. Au contraire, la lignée p65/RelA WT a la plus faible proportion de cellules (24%)

113 en phase S. La lignée p65/RelA D361E conserve une position intermédiaire avec une proportion de moyenne 25 % de cellules en phase S. En phase G2, p65/RelA D361E présente la plus faible proportion de cellules (10%), tandis que p65/RelA WT et p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 sont présents en plus grande proportion (13%). Cependant l’ensemble de ces résultats n’est pas significatif.

Ces différences entre les lignées pour chacune des phases du cycle cellulaire sont minimes, légères et non significatif que ce soit à J0 ou au bout de 48H. Aucun profil caractéristique d’un des mutants de p65/RelA ne peut être déterminé. Ainsi, ces différents mutants n’influencent pas le déroulement du cycle cellulaire. La différence de profil tumorigène ne peut s’expliquer par une modification de l’évolution du cycle cellulaire.

Ainsi, l’étude in vitro de la prolifération et du cycle cellulaire n’a pas permis d’expliquer une différence de tumorigenèse lorsque l’un des mutants de p65/RelA est exprimé. Cette différence peut être due à d’autres mécanismes.