Création des lignées

L'expression de RIP3KD induit un clivage par la caspase-6 de la sous-unité p65/RelA de NF-B à l'acide aspartique D361. Afin d’obtenir des lignées exprimant la protéine p65/RelA ou ses mutants, les lignées DA1-3b et B16 ont été transfectées avec les différents plasmides codant pour l’expression de p65/RelA WT ou de ses mutants associée à une expression de la protéine fluorescente DsRed (Schéma 1).

Schéma 1 : Les différents mutants de la

protéine p65/RelA : A partir de la protéine p65/RelA, différents mutants ont été construits. Le p65/RelA muté sur son acide aminé 361 est non clivable. Le fragment N Ter ne possède que le domaine N-Terminal (1-361) obtenu par clivage de la protéine p65/RelA WT. Le fragment C Ter ne possède que le domaine C- Terminal (362-551) obtenu par clivage de la protéine p65/RelA WT. Le dernier mutant correspond à la coexpression des fragments N Ter et C Ter. Chaque mutant exprime en N Ter le Myc TAG (sauf le fragment C Ter) et en C Ter le His TAG (sauf le fragment N Ter).

A) Modèle leucémique

Après transfection, les lignées DA1-3b sont sélectionnées par la Blasticidine. Une dilution limite par tri cellulaire est réalisée. A partir du taux d’expression de la DsRed, les clones exprimant le plus fortement possible la protéine fluorescente DsRed ont été retenus (Figure 41).

101 Figure 41 : Mesure du taux d’expression de la protéine DsRed dans les différents clones obtenus : Après transfection des différents plasmides codant pour la protéine p65/RelA WT ou ses mutants : p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361, p65/RelA 362-549, p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549, différents clones sont obtenus par tri cytométrique. Le taux d’expression de la DsRed au sein de ces clones est déterminé par la mesure de sa fluorescence par cytométrie de flux.

L’expression de la DsRed est forte pour l’ensemble des clones excepté ceux exprimant les deux fragments p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549. Malgré plusieurs tentatives, l’intensité de fluorescence de la DsRed n’augmente pas davantage lorsque les deux fragments sont exprimés. La présence d’une séquence IRES dans le plasmide est peut-être responsable de cette faible fluorescence de la protéine DsRed.

Pour les clones sélectionnés qui ont une intensité de fluorescence forte, l’expression de la protéine p65/RelA WT ou de ses mutants p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361, p65/RelA 362-549, p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 est vérifiée par Western blot. Les anticorps ciblant uniquement les tags présents soit en N-Terminal soit en C-Terminal de la protéine p65/RelA sont utilisés afin de bien distinguer l’expression basale de la protéine p65/RelA présente dans tous les clones avec la surexpression induite par la présence des plasmides (Figure 42).

102 Figure 42 : Validation de l’expression de p65/RelA WT ou de ses mutants p65/RelA D361E, p65/RelA

1-361, p65/RelA 362-549 et p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 dans les différents clones issus de la

lignée leucémique mère DA1-3b par Western Blot à l’aide d’anticorps dirigés contre Myc-Tag (présent en N-Terminal de nos constructions) ; contre His-Tag (situé en C-Terminal de nos constructions). L’anticorps dirigé contre la protéine GAPDH sert de contrôle. Issu du clivage, le fragment p65/RelA 1-361 fait 50kDa tandis que le fragment p65/RelA 362-549 fait 20kDa.

Les clones ici présents représentent un exemple de l’ensemble des clones testés. Seules les bandes d’intérêt correspondantes au fragment exprimé sont montrées ici. La protéine p65/RelA WT ou celle mutée p65/RelA D361E sont présentes dans la cellule sous leur forme totale. Donc, elles possèdent à chaque extrémité un tag : le Myc Tag en N-Terminal et le His Tag en C-Terminal. Dans le western blot ci-dessus (Figure 42), on observe bien que l’ensemble des clones exprimant l’une des deux protéines : la forme sauvage ou la forme mutée présentent une belle bande d’expression correspondante à celle du His Tag. La bande correspondante à l’expression du tag His du clone F3 transfecté avec le plasmide codant pour la protéine p65/RelA D361E est relativement plus faible que celles des trois autres clones ayant reçu le même plasmide. Le fragment p65/RelA 1-361 est associé uniquement à l’expression du tag Myc étant dépourvu d’extrémité C-Terminale. Le western blot confirme l’expression de ce fragment dans les clones transfectés avec le plasmide correspondant. Néanmoins, cette expression est très faible chez le clone E5’. Inversement, le fragment p65/RelA 362-549 est lié uniquement avec le tag His (Schéma 1). Cette expression est retrouvée pour chaque clone testé. Le clone D1’ est celui qui l’exprime le plus fortement. Par contre, la coexpression des deux fragments p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 nécessite la

103 présence des deux tags à des tailles différentes. Le fragment p65/RelA 1-361 est le plus long avec un poids moléculaire de 50kDa. Tandis que le fragment p65/RelA 362-549 est le plus court avec un poids moléculaire de 20kDa. L’ensemble des clones testés ne présente pas de bandes correspondantes aux deux tags. Ces clones correspondants (G10’ ; B4’ ; B8’ ; F2’ ; H11’) sont donc éliminés. Le degré d’expression varie selon le clone testé. De façon générale, l’expression du tag His est plus marquée que celle du tag Myc. Seul le clone D11 semble exprimer davantage le tag Myc que le tag His au vue de l’intensité des bandes correspondantes.

Parmi l’ensemble des clones testés, seuls ceux exprimant fortement les deux tags ou l’un des deux pour les fragments sont sélectionnés. Pour chaque lignée correspondante, les clones sélectionnés sont mélangés pour former un bulk de clones. Ainsi, nous essayons de nous rapprocher de la diversité clonogénique qu’il peut exister chez le patient. Un nouveau western blot est réalisé pour valider le modèle (Figure 43).

Figure 43 : Validation de l’expression de

p65/RelA WT ou de ses mutants p65/RelA D361E, p65/RelA 1-361, p65/RelA 362-549 et p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 dans le bulk de clones par Western Blot à l’aide

d’anticorps dirigés contre Myc-Tag (présent en N-Terminal de nos constructions) ; contre His- Tag (situé en C-Terminal de nos constructions). L’anticorps dirigé contre la protéine GAPDH sert de contrôle. Issu du clivage, le fragment p65/RelA 1-361 fait 50kDa tandis que le fragment p65/RelA 362- 549 fait 20 kDa

Le résultat confirme l’absence d’expression des deux tags Myc et His dans la lignée Void. L’expression des deux tags Myc et His est bien sûr retrouvée dans les deux lignées exprimant soit p65/RelA WT soit p65/RelA D361E. Cependant, l’expression du tag Myc parait plus faible que celle du tag His pour la lignée exprimant p65/RelA D361E. Pourtant leur expression est simultanée et fusionnée à la protéine p65/RelA. Les deux bandes exprimant chacune des deux tags sont à la taille. Il pourrait donc plutôt s’agir d’un souci technique d’anticorps qui s’est moins accroché sur la membrane ou au moment de la révélation. La lignée exprimant uniquement le fragment p65/RelA 1-361 a une bande d’expression uniquement pour le tag Myc présent en N-Terminal. Inversement, la lignée

104 exprimant le fragment p65/RelA 362-549 n’exprime que le tag His situé en C-terminal de la protéine. Enfin, la lignée exprimant les deux fragments p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 présente deux bandes correspondantes aux tags Myc et His. Chaque bande est observée à la taille attendue. On note néanmoins une différence inexpliquée entre l’expression faible de la DsRed et celle de certains mutants (p65/RelA 1-361 + p65/RelA 362-549 avec DsRed forte, p65/RelA 1-361 ou p65/RelA 362-549 avec DsRed faible).

Enfin pour terminer la validation du modèle, les différents clones sont séquencés afin de confirmer l’absence de mutations dans la séquence des différentes protéines. (Résultats non montrés).