Les effets sublétaux

Si elle ne provoque pas la mort de l’individu, la toxicité aiguë ou la toxicité chronique d’une substance peuvent être à l’origine d’effets délétères plus discrets qualifiés de sublétaux. Il s’agit d’altérations de la physiologie ou du comportement des abeilles qui diminuent leur vitalité ou affectent leur activité au sein de la colonie. Ces effets peuvent être mis en évidence au laboratoire mais également en conditions naturelles grâce à la mise en œuvre de nouvelles technologies comme le compteur à abeille (Dusaubat et al., 2013) ou les puces RFID (Decourtye et al., 2010 ; Henry et al., 2012). Les effets d’une substance toxique sur un organisme peuvent être multiples et dépendants ou indépendants de leur mode d’action primaire, c’est pourquoi il est souvent difficile de pronostiquer quelle fonction de l’organisme sera affectée au cours ou à la suite d’une exposition. Il peut s’agir de fonctions cognitives mises en jeu dans la réalisation de taches importantes pour la colonie comme le butinage ou de fonctions physiologiques impliquées dans la survie ou la défense de l’individu comme l’immunité et la détoxification.

La plupart des méthodes permettant d’étudier des effets sublétaux comportementaux se sont focalisées sur les fonctions d’apprentissage et d’orientation des abeilles, deux fonctions essentielles à la récolte du précieux nectar. Les effets sublétaux sur l’apprentissage peuvent par exemple être testés

affecte l’apprentissage d’une odeur chez une butineuse (Giurfa & Sandoz, 2011) ou encore par le test pratiqué dans un labyrinthe et qui permet d’étudier l’effet d’une substance sur les capacités d’orientation d’abeilles placées sur un parcours préalablement appris (Zhang & Maleszka 2006). D’autres méthodes permettant d’évaluer les effets sublétaux de substance sur l’orientation des abeilles ont été développées, mais la dernière en date présente un intérêt particulier puisqu’elle permet d’étudier en conditions naturelles, le vol de retour des butineuses marquées avec des puces RFID qui signale leur arrivée dans la ruche grâce à un dispositif de détection électronique. Grâce à cette méthode Henry et al., (2012) ont récemment pu montrer que des butineuses exposées dans le champ à des doses sublétales de thiaméthoxame mettaient plus de temps à retourner dans la ruche, quand elles ne se perdaient pas totalement.

A doses sublétales, certaines substances modifient la physiologie des abeilles ce qui peut altérer leur vitalité ou leur résistance à d’autres agents de stress chimiques ou biologiques. Pour évaluer ces effets sublétaux, de nombreuses méthodes de biochimie et de biologie moléculaire peuvent être mises en œuvre et permettent de mesurer des changements d’activités ou d’expressions de protéines à la suite d’une exposition aiguë ou chronique. Il peut s’agir de dosages enzymatiques, d’immuno-marquage ou encore de PCR quantitative. Dans la littérature, on peut constater que les recherches sur les effets sublétaux physiologiques induits par des substances toxiques se sont principalement focalisées sur les systèmes immunitaires, de détoxication et nerveux de l’abeille. En effet, il est fréquent que des substances neurotoxiques par exemple modulent l’activité du système immunitaire des abeilles (Alaux et al., 2009 ; Gregorc et al., 2012 ; Boncristiani et al., 2012). Cela expliquerait pourquoi il est rapporté dans certaines publications que des abeilles exposées à des doses sublétales de toxique succombent plus rapidement à une infection (Aufauvre et al., 2012) ou que des agents infectieux se développent davantage dans les colonies fortement contaminées par des pesticides (Pettis et al 2012 ; Wu et al., 2011) .

PROBLEMATIQUE

&

Face au plus dévastateur des parasites de l’abeille européenne Apis mellifera (Rosenkranz et al., 2010), les apiculteurs ont dû recourir à l’utilisation de toute une batterie d’acaricides tels que l’amitraze (formamide), le coumaphos (organophosphoré) ou le fluvalinate (pyréthrinoïde). Leur utilisation intensive s’est d’une part traduite par l’émergence de résistances chez le parasite (Rosenkranz et al, 2010), et donc par une baisse d’efficacité des traitements (Lodesani et al., 1995), mais également par une accumulation de ces molécules dans les produits de la ruche (miel, cire et pollen) (Lodesani et al., 1995) engendrant des répercussions sur la santé de l’abeille (Rosenkranz et al., 2010 ; Burley et al., 2008 ; Boncristiani et al., 2012). Les produits dits naturels sont alors apparus comme une alternative à la chimie et sont désormais de plus en plus utilisés, avec parmi eux le thymol sous ses différentes formulations (Apiguard®, Thymovar® et Apilfe®) ou encore en cocktail artisanal. Comme les autres acaricides utilisés dans la lutte anti-Varroa, les résidus de thymol se concentrent dans la ruche et en particulier dans la cire (Bogdanov et al., 1998 ; Floris et al., 2004) dû à la nature lipophile de ce composé, mais également dans le pollen et le miel (Rennich et al., 2012 ; Bogdanov et al., 1998 ; Floris et al., 2004 ; Adamczyk et al., 2005 ; Nozal et al., 2002). Or le pollen et le miel sont les principaux constituants de la bouillie larvaire produite et distribuée par les abeilles nourrices aux larves qui sont ainsi susceptibles d’absorber d’importantes quantités de thymol. Dans ce contexte, il apparaît donc crucial de s’assurer de l’absence d’effets toxiques du thymol sur la colonie et en premier lieu sur le couvain qui assure le renouvellement de la ruche.

Récemment, plusieurs études ont montré que le traitement au thymol entraînait un changement de comportement des adultes (Imdorf, 1995 ; Mattila, 2000), ou encore qu’une intoxication expérimentale diminuait la survie d’abeilles adultes en laboratoire (Damiani, 2009). Certaines études désigneraient même le thymol comme un larvicide : Gashout and Guzmàn-Novoa ont démontré en 2009 que l’huile de thym aurait une plus grande toxicité pour les larves que pour l’abeille adulte, alors que d’autres études montrent une mortalité pour les larves après traitement des ruches (Mattila et al., 2000 ; Imdorf et al., 1995). Le couvain serait dès lors exposé à un fort risque d’intoxication.

Face à ces données inquiétantes, des travaux restaient à mener pour investiguer plus finement les effets du thymol sur le développement du couvain d’abeilles, mais aussi dans des conditions plus appropriées à l’étude de la toxicité d’une substance chez un insecte social. C’est à cette tâche que notre recherche doctorale vise à contribuer.

Le premier objectif a donc été de s’affranchir de l’influence de l’environnement social de l’abeille pour déterminer la toxicité du thymol mais également de suivre les effets du thymol sur la totalité du développement larvaire. Pour cela, il existe une méthode de laboratoire très adaptée qui permet d’une part d’étudier la toxicité de substances sur des larves d’abeille in vitro, mais également sur la totalité

PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS SCIENTIFIQUES

du développement larvaire puisque près de 95% des individus ont un développement complet (Aupinel et al., 2005 ; Hendriksma et al., 2011). C’est précisément cette technique qui a été adaptée au laboratoire dans le cadre des travaux doctoraux pour investiguer la toxicité du thymol sur le couvain d’abeilles. Ces premiers travaux constituent le premier objectif et ont été fondamentaux puisque la validité de tous les résultats obtenus durant la thèse était directement conditionnée par l’optimisation et par la reproductibilité des conditions d’élevage. Ces premiers travaux ont consisté à contrôler parfaitement les conditions d’élevage larvaire en veillant particulièrement à la maîtrise de certains paramètres biotiques et abiotiques de l’environnement larvaire, mais également à la maîtrise de la technique de greffage.

Une fois le système d’élevage in vitro parfaitement établi, le second objectif du travail de cette thèse a consisté à étudier les effets létaux du thymol sur le développement des larves d’abeilles, avec dans un premier temps la détermination des concentrations en thymol ayant un effet sur la mortalité larvaire jusqu’au début du stade nymphe aux yeux blancs, suite à une exposition via la cire et l’alimentation. Les paramètres de toxicité aiguë et chronique du thymol ont été déterminés par le calcul de la concentration induisant 50% de mortalité des abeilles présentes initialement (CL50) et par la dose de thymol induisant 50% de mortalité de la population initiale (DL50). Les temps d’exposition choisis correspondent à deux périodes clefs : pendant les 2 premiers jours d’élevage, c’est-à-dire à la fin de la consommation de la gelée royale pure et pendant les 6 premiers jours c'est-à-dire jusqu’à la fin du stade larvaire.

Des études encore plus récentes menées en 2012 par l’équipe de Boncristiani ont montré que le thymol induisait des variations d’expression du gène de la vitellogénine, une protéine pléiotropique impliquée notamment dans le développement, une variation d’expression de certaines P450, impliquées dans le système de détoxification de phase I et des variations d’expression d’un facteur de transcription impliqué dans l’immunité cellulaire. Ces données viennent s’ajouter à celles de Loucif-Ayad qui avait démontré en 2008 que le thymol induisait un stress oxydatif caractérisé par une augmentation de l’activité de la Glutathion S-Transférase chez les abeilles adultes et suggèrent que l’intoxication par le thymol puisse avoir des effets sublétaux sur différents systèmes biologiques de l’abeille.

Or, bien que plus difficilement décelables que les effets létaux, les effets sublétaux d’un composé sont néanmoins de nature délétère, affaiblissant la population intoxiquée et la rendant de fait, plus vulnérable aux pathogènes ou aux changements environnementaux (Suchail et al., 2001 ; Vidau et al., 2011 ; Boncristiani et al., 2012. Le troisième objectif de la thèse a donc visé à déterminer les effets sublétaux d’une alimentation contaminée au thymol sur différents paramètres développementaux que sont la croissance pondérale, l’expression de marqueurs de transcription génique de l’immunité et du développement (abaecine, vitellogénine, serpine 5, protéase à sérine 14, lysozyme, prophénol oxydase)

et l’activité enzymatique (glucose deshydrogénase, Glutathion S-Transférase, lysozyme, phénol oxydase).

Enfin, la comparaison des résultats de cette étude avec les données bibliographiques sur les niveaux de résidus de thymol dans les cires, le miel et le pollen des colonies traitées contre Varroa à l’aide de ce composé a permis de conclure quant au risque encouru par les larves d’abeille exposées à ce composé via la cire et l’alimentation.