Le contrôle drastique de la constance des paramètres biotiques et abiotiques de l’élevage larvaire était une étape indispensable à la réalisation de l’étude de la toxicité aiguë et chronique du thymol. Au cours de cette étude, le taux de mortalité larvaire à l’étape du greffage, l’hygrométrie dans les caissons d’élevage et le niveau de contamination de la nourriture larvaire étaient autant de paramètres susceptibles de varier. Ils ont donc fait l’objet d’un contrôle préalable à cette étude.
II.1.
Contrôle de la maîtrise de la technique de greffage
La maîtrise de la technique de greffage est longue à acquérir. Il faut compter au moins un mois d’apprentissage pour réussir à limiter les blessures et les traumatismes infligés aux larves au cours de cette étape à leur strict minimum. L’évaluation du degré de maîtrise se fait par la détermination du pourcentage de mortalité à la fin du stade larvaire. Celui-ci ne doit pas excéder 15% selon Aupinel et al. (2009). Cette évaluation se déroule en deux étapes qui permettent de contrôler, pour la première la qualité du geste et pour la seconde la capacité du manipulateur à répéter ce geste un grand nombre de fois. Dans cette étude, une troisième étape visant à évaluer une adaptation de la méthode à l’emploi d’un très grand nombre de larves a été ajoutée.
II.2.
Contrôle de la qualité du geste de greffage réalisé par le manipulateur
La qualité du greffage réalisé par le manipulateur a été évaluée lorsque celui-ci était effectué sur un petit nombre de larves, c’est-à-dire sans que la fatigue ni le grand nombre de manipulations connexes n’entrent en ligne de compte. Dans ce but, 48 larves au stade L1 ont été greffées dans un dispositif d’élevage contenant pour moitié des cupules en plastique et pour moitié des cupules en cire. Le dispositif a été incubé et les larves nourries selon la méthode décrite précédemment.
II.2.1
Contrôle de la qualité du greffage sur un grand nombre de larves en
randomisant les larves à l’échelle de l’ensemble des supports d’élevage
288 larves au stade L1 ont été greffées dans 6 dispositifs d’élevage contenant pour moitié des cupules en plastique et pour moitié des cupules en cire. Selon la méthode originelle, les dispositifs d’élevage ont tous été disposés sur la paillasse et greffés simultanément, en appliquant une homogénéisation de la répartition des individus sur l’ensemble des dispositifs d’élevage et ce, afin de ne pas introduire de biais expérimental via la sélection visuelle des larves au cours du prélèvement (Aupinel et al., 2005). La survie larvaire a ensuite été mesurée comme décrit précédemment.
II.2.2
Contrôle de la qualité du greffage sur un grand nombre de larves en
randomisant les larves à l’échelle de chaque dispositif d’élevage.
Afin d’évaluer l’effet sur la mortalité larvaire de l’adaptation de la méthode décrite par Aupinel et al. (2005) consistant à greffer chaque dispositif l’un après l’autre avec une homogénéisation de la distribution des larves non pas à l’échelle de l’ensemble des dispositifs, mais à l’échelle de chaque dispositif d’élevage, 288 larves au stade L1 ont été greffées dans des cupules en plastique successivement dans les 6 dispositifs d’élevage. Les dispositifs ont ensuite été incubés et la survie larvaire a été mesurée comme décrit précédemment.
II.2.3
Contrôle de l’hygrométrie dans les caissons d’élevage
II.2.3.1 Contrôle du délai d’obtention de l’hygrométrie optimale à l’élevage larvaire
Le délai nécessaire à la saturation en eau de l’air contenu dans les caissons d’élevage après introduction des solutions saturées a été déterminé pour les deux types de caissons : ceux contenant une solution saturée avec des sels de K2SO4, destinés à l’élevage des larves, et ceux contenant une
solution saturée avec des sels de NaCl, destinés à accueillir les nymphes en métamorphose. Dans ce but, un récipient contenant un litre de l’une ou l’autre des solutions saturées en sels a été placé dans un caisson d’élevage dans lequel avait été préalablement introduit un hygromètre à cheveux (VWR). L’hygrométrie a ensuite été relevée dans chaque caisson par lecture directe à travers les parois transparentes des caissons 12, 24, 48, 72 et 96 h après fermeture des portes et incubation à 34°C.
II.2.3.2 Contrôle de la cinétique de stabilisation de l’hygrométrie dans les caissons d’élevage après ouverture de la porte.
Le délai nécessaire à la restauration de l’hygrométrie maximale dans les caissons d’élevage a été déterminé après une brève ouverture des portes, nécessaire à la manipulation des supports d’élevage pour le nourrissage et à l’observation des larves et des nymphes. Pour cela, les portes de chaque caisson ont été ouvertes pendant 30 secondes et l’hygrométrie a été mesurée après 15, 30 et 60 min dans les conditions décrites précédemment.
CONTROLE DES conditions d'élevage larvaire
II.2.3.3 Contrôle du niveau de contamination de la nourriture larvaire
Les larves sont sensibles à différents agents pathogènes parmi lesquels la bactérie Paenibacillus larvae, responsable de la loque américaine, est la plus connue. Les individus les plus sensibles à cette bactérie sont les larves de stade L1 (Evans, 2004) chez lesquelles la bactérie produit une septicémie caractérisée par une activation du système immunitaire qui se traduit par une production 5 fois supérieure au taux de base de l’abaecine et de la défensine (Evans, 2004). D’autres bactéries, y compris des bactéries commensales humaines telles Escherichia coli, non pathogène pour la larve d’abeille génèrent également une réponse immunitaire chez les larves (Randolt et al., 2008). La présence de bactéries dans la nourriture larvaire aurait donc été une source de biais potentiel pour l’étude des effets du thymol sur l’immunité larvaire. Le contrôle de l’absence de bactéries dans la nourriture larvaire a donc été un préalable à cette étude.
II.2.3.4 Contrôle du niveau de contamination de la nourriture larvaire provenant de la ruche et des aliments A, B et C préparés au laboratoire.
Le niveau de contamination de la nourriture larvaire produite par les nourrices et distribuée aux larves à leur naissance a été déterminé à partir de la gelée royale prélevée sur un cadre de couvain contenant des larves au stade L1 fraîchement nées par ajout de 10 µL de PBS (pH = 7,4) utilisé ici comme solution d’entraînement, suivi d’une agitation par 10 aspirations et refoulements. La solution a ensuite été diluée dans 90 µL de PBS, étalée sur une gélose cœur cervelle et incubée à 34°C pendant 48 h avant dénombrement des colonies. Cette manipulation a été répétée 10 fois sur chacune des quatre ruches.
En ce qui concerne le niveau de contamination de l’aliment préparé au laboratoire, celui-ci a été déterminé à partir de 10 µL d’aliment rapidement décongelés et amenés à température ambiante dilués et incubés comme décrit précédemment. Chaque aliment a été testé en tripliquât.
En ce qui concerne le contrôle du niveau de contamination de l’aliment préparé au laboratoire après contact avec une larve, il convient de préciser que les larves ne défèquent pas avant le stade LS, après la consommation totale de la nourriture larvaire. La contamination de la nourriture larvaire par la larve ne peut donc se faire que par contact lors du greffage. C’est la raison pour laquelle le niveau de contamination de l’aliment préparé au laboratoire a été déterminé après que celui-ci a été mis en contact avec une larve au stade L1 prélevée dans une colonie. Pour ce faire, une cupule d’élevage greffée avec une larve au stade L1 déposée sur 50 µL d’aliments préparés au laboratoire, a été incubée à 34°C et 95% d’humidité pendant 48 h. Dix microlitres de reliquat d’aliment non consommé par la larve ont ensuite été prélevés, dilués et cultivés comme décrit précédemment. Le test a été réalisé en tripliquât pour l’aliment A uniquement (le seul en contact avec la larve provenant directement de la colonie) en employant des larves de chacune des quatre colonies.