Pour comprendre l’effet probable des EsO de P. scoparius sur la microstructure des émulsions étudiées, il était impératif de focaliser l’étude sur la phase grasse des émulsions abordées. Celle-ci est constituée des huiles végétales précédemment citées (PO, SBO et SFO). L’étude de l’effet des EsO sur ces huiles végétales implique l’investigation de l’effet sur leur cristallisation.
Les huiles végétales utilisées dans le cadre de cette investigation ont été achetés dans un marché local aux Etats-Unis (Logan, UT, USA). Les huiles de soja (SBO) et de tournesol (SFO) proviennent de Kroger (Ohio, USA) alors que l’huile de palme (PO) provient de l’entreprise ADM (Illinois, USA). Un mélange de PO, SBO et SFO a été préparé dans les proportions 2:1:1, m/m/m respectivement, afin de reproduire les proportions usitées pour formuler les émulsions étudiées. Des échantillons de PO en mélange ou non avec les huiles végétales précédentes (Mix), contenant 5% (m/m) de chacune des EsO de P. scoparius (tiges et fleurs) ont été préparés par addition de 50 mg des EsO dans 1 g des huiles végétales correspondantes (préalablement chauffées par microonde pendant 2 min pour permettre leur fusion complète). Ces EsO ont été mélangées et homogénéisées avec les huiles végétales, en remuant délicatement avec une spatule. Un total de 6 échantillons ont été préparés: (i) PO sans EsO, (ii) PO avec addition de 5% de EsOF, (iii) PO avec addition de 5% de EsOS, (iv) Mix sans EsO, (v) Mix avec addition de 5% de EsOF et (vi) Mix avec addition de 5% de EsOS.
6.1. Evaluation du point de fusion
Les points de fusion des échantillons étudiés ont été déterminés par la méthode du tube capillaire selon la méthode officielle de l’AOCS Cc 1-25. Des tubes capillaires contenant les échantillons de corps gras (incorporés ou non des EsO) ont été placés à -20 °C durant la nuit. Ensuite, les tubes sont sortis du congélateur et essuyés à leur base par du papier fin. Ils sont fixés à un thermomètre, submergés dans un bécher rempli d’eau froide et chauffés sous agitation continue (vitesse de chauffage de 0,5 °C/min). Le point de fusion correspond à la température à laquelle le corps gras, formant une colonne à l’intérieur du tube capillaire, commence à monter
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Matériels et Méthodes
en raison de la pression hydrostatique (ramollissement de la matière grasse à l’intérieur du tube capillaire sous l’effet de l’augmentation de la température). Au moment où la colonne du corps gras commence à monter à l’intérieur du tube capillaire, la température s’affichant sur l’écran du thermocouple est prise comme étant le point de fusion. Un minimum de trois tubes capillaires est préparé pour le même échantillon à chaque fois. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type standard.
6.2. Analyse thermique par calorimétrie différentielle à balayage
Le comportement à la fusion et à la cristallisation des échantillons étudiés ont été évalués par DSC en mode isotherme sur un calorimètre Q20 DSC doté d’un système de refroidissement RCS (TA instruments, New Castle, DE, USA). La ligne de base et la température en DSC ont été calibrées avec un étalon en indium pur. Un creuset en aluminium scellé et vide a été utilisé comme référence. Les échantillons ont été pesés (10-15 mg) dans des creusets en aluminium hermétique Tzero (TA instruments), ensuite couverts et scellés avec des couvercles en aluminium et sertis sous presse. La procédure de cristallisation en mode isotherme a consisté à chauffer les échantillons à 60 °C et à les maintenir ainsi pendant 15 min (assurer une fusion complète et effacer toute mémoire cristalline de l’échantillon). Le système a ensuite été refroidi de 60 °C aux températures de cristallisation (Tc) de 20, 21, 22, 23, et 24 °C, cas des échantillons de PO, PO + 5% EsOF, PO + 5% EsOS, et 10, 13, 15, 17, et 20 °C, cas des échantillons de Mix, Mix + 5% EsOF et Mix + 5% EsOS à une vitesse de température de programmation de 5 °C/min. Les échantillons ont été maintenus à leurs Tc respectives pendant 60 min, puis chauffés à une vitesse de température de 5 °C/min pour obtenir des endothermes de fusion des échantillons précédemment cristallisés. Les propriétés et paramètres de cristallisation et de fusion ont été calculés à par le logiciel d’analyse TA Universal Analysis. Les paramètres de cristallisation incluent le temps de début de cristallisation (ton), le temps de pic de cristallisation (tc) et l’enthalpie de cristallisation (ΔHc). Quant aux paramètres de fusion, ils comprennent la température de début de fusion (Ton), la température de pic de fusion (Tp) et l’enthalpie de fusion (ΔHm). Le temps zéro pour les paramètres ton et Tc correspond au temps pour lequel l’échantillon atteint la température de cristallisation. Par conséquent, ces paramètres ont été calculés sur la base de la différence entre le temps nécessaire pour atteindre le début ou le pic de cristallisation et le temps nécessaire pour atteindre la température de cristallisation. Les températures de cristallisation ont été choisies pour obtenir un temps d’induction de cristallisation entre zéro et 60 min.
82 6.3. Détermination du taux de solide (SFC)
Le taux de solide des échantillons étudiés (SFC) a été évalué par résonance magnétique nucléaire pulsée à basse résolution (RMN-p) ou p-NMR (pour pulsed nuclear magnetic resonance) à l’aide d’un spectromètre RMN Minispec MQ 20 (Bruker, Allemagne). Les échantillons ont été portés à fusion dans une étuve à 60 °C, puis homogénéisés en remuant les échantillons avec une tige en verre. Les échantillons sont mis à l’intérieur des tubes RMN à hauteur de 5 cm, à l’aide d’une pipette Pasteur (l’étiquetage des échantillons est réalisé sur les bouchons des tubes et non sur leurs surfaces). Ensuite, Les tubes RMN contenant les échantillons étudiés (4 tubes RMN pour chaque échantillon) ont été placés dans un bain Marie (t = 0 ; temps de la première introduction des quatre tubes RMN simultanément dans le bain Marie) et maintenus aux températures de cristallisation correspondantes (Tc) pour une durée de 60 min. Les SFC ont été mesurés à partir de t = 0 en fonction du temps, en utilisant les quatre tubes RMN mesurés séquentiellement et immédiatement remis dans le bain d’eau après chaque mesure réalisée. Les valeurs SFC ont été mesurées toutes les 2 min pendant 60 min.
Les mesures faites sur les échantillons étudiés ont été effectuées en triplicat et les valeurs moyennes ont fait l’objet d’un ajustement (fitting) en appliquant le modèle d’Avrami:
𝑆𝐹𝐶 = 𝑆𝐹𝐶𝑚 (1 − 𝑒−𝑘𝑛 𝑥 𝑡𝑛)
Où : t est le temps, kn est la constante de vitesse, SFCm est le SFC maximal obtenu lorsque l’échantillon atteint l’équilibre, et n représente l’indice de la réaction.
6.4. Analyse de la morphologie cristalline
La microstructure des cristaux obtenus pour les échantillons étudiés a été observée à l’aide d’un microscope à lumière polarisée (Olympus BX41, Olympus Optical Co., Tokyo, Japan) équipé d’un appareil de photographie numérique et d’un logiciel de capture des images (Lumenera Infinity 2, Lumenera Corp., Nepean, Canada). Une quantité minime de l’échantillon est chauffée au préalable par microondes pendant 2 min. Celle-ci est ensuite homogénéisée en remuant avec une spatule. Une goutte minuscule de l’échantillon est déposée sur la lame en verre et recouverte d’une lamelle. Une procédure isotherme, semblable à celle utilisée en DSC, est appliquée pour tous les échantillons (PO et Mix, avec et sans EsO). Un grossissement de 10X est utilisé. L’analyse cristalline des échantillons est réalisée à l’aide du logiciel image J (Version 1,43, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Un triplicat d’images a été effectué pour les échantillons étudiés et trois paramètres ont été évalués: la circularité (C), la
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Matériels et Méthodes
surface totale (TA) et le diamètre minimum (MinD) rapportés soit comme moyenne ± SD (C) ou moyenne ± SE (TA et MinD).
La taille des cristaux a été aussi évaluée en utilisant un logiciel plus performant (Image-Pro Premier) (version 9.2.22, Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Un triplicat d’images a été traité dans chaque cas et la taille des cristaux a été analysée par le calcul du rayon (m) exprimé en moyenne écart-type standard.