Caractérisation chromatographique des huiles essentielles de P. scoparius

Pour la présente analyse chromatographique (Figure 24), les EsO de P. scoparius issues de l’extraction par hydrodistillation à partir des tiges fraîches (fresh plant : FP) et sèches (dried plant : DP) de la plante. Ces EsO ont été diluées avec de l’acétate d’éthyle à 1:30 (v/v). Pour le screening des terpènes sur couche mince, une plaque de gel de silice 60 couche mince (TLC) de dimensions 5 cm X 10 cm (Merck, Darmstatd, Germany) (Lot n° 1. 05553) a été utilisée. La plaque a été développée dans une chambre de développement chromatographique à double puits (CAMAG, Muttenz, Switzerland). Un volume de 5 µL de la solution de l’EsO diluée a été appliqué sous forme de bandelettes de 5 mm d’épaisseur, à 8 mm du bas de la plaque et à 15 mm du bord gauche de la plaque (l’espace entre deux bandes successives a été fixé à 10 mm), à l’aide d’une seringue CAMAG d’un volume de 25 µL en utilisant un échantillonneur automatique CAMAG ATS4 sur la plaque TLC à 1 cm du bord inférieur de la plaque. Celle-ci a été d’abord développée dans l’isooctane sur une hauteur de 8 cm de la plaque (qui délimite le front de migration des composés de l’EsO). Le second développement a été effectué sur une hauteur de 5 cm de la plaque, avec un solvant de développement constitué de n-hexane-acétate d’éthyle (5:1, v/v). Pour les deux développements chromatographiques, 10 mL du solvant de développement (isooctane et mélange de n-hexane-acétate d’éthyle) a été utilisé sans saturation préalable de la chambre de développement. Une fois le développement achevé, la plaque a été séchée par de l’air relativement ambiant (séchoir domestique) avant l’étape de révélation chimique. La révélation post-chromatographique a été réalisée en chauffant la plaque (au préalable développée) à 110 °C pendant 3 min sur une plaque chauffante type CAMAG. Immédiatement après le chauffage, la plaque a été pulvérisée avec le réactif de détection et de révélation (quelques sprays avec le réactif Anisaldéhyde sur la plaque) pendant 1 min. La capture d’images de la plaque chromatographique a été effectuée à l’aide du système d’image DigiStore 2 (CAMAG) qui opère à l’aide du logiciel WinCATS version 1.4.1.8154. En parallèle à ce développement chromatographique, un autre développement sur une plaque couche mince haute performance (HPTLC) a été effectué pour l’analyse densitométrique. A cet effet, une plaque HPTLC gel de silice 60 (F254) munie d’un agent fluorescent sous UV de dimensions 10 cm X 10 cm (Merck, Darmstatd, Germany) (Lot n° 1. 05629). La même procédure de développement chromatographique précédente a été adoptée, avec dépôt de 10 µL de solutions étalons (α-pinène, β-pinène, α-terpinène, α-phellandrène et p-cymène) préparées dans l’acétate

70 d’éthyle pur (0,1 mL/0,2 mL, v/v). Les plaques ont été scannées à λ = 500 nm en utilisant un Scanner TLC III (CAMAG), la dimension de la fente a été maintenue à 3,00 mm X 0,30 mm avec une vitesse de balayage de 20 mm/s et une résolution des données de 100 µm/pas.

2.1.2. Analyse des composés volatils par MHE-GC-FID-MS

Cette analyse a été effectuée sur chromatographe gazeux Focus GC (Thermo Fisher Scientific, USA) couplé à un échantillonneur automatique headspace HS 40 XL (Perkin Elmer, USA). L’identification GC-MS a été effectuée sur un chromatographe gazeux GC Trace Ultra couplé à un spectromètre de masse de type DSQ II single-quad (Thermo Fisher Scientific, USA). Les conditions opératoires pour MHE et GC-FID sont comme suit : gaz vecteur (hélium), température du four (145 °C), température de l’aiguille d’injection (265 °C), température de transfert (190 °C), pressurisation (270 kPa), temps du thermostat (35 min), temps de pressurisation (0,6 min) et temps d’injection (0,04 min). Nombre d’injection MHE (3), débit d’écoulement (2,0 mL/min, écoulement constant), rapport split (1:25), température d’entrée (280 °C), température du détecteur FID (280 °C). Caractéristiques de la colonne GC : ZB-5MSi, 30 m X 0,25 mm X 0,25 µm (Phenomenex, USA), programme de température dans le four : 50 °C (0,5 min) à 105 °C (15 °C/min), puis 180 °C à 30 °C/min et 250 °C à 10 °C/min (1 min). L’identification MHE-GC-MS des composés volatils a été réalisée en injectant des solutions (EsO-acétate d’éthyle) de 1% (v/v). Les échantillons de la plante sont d’abord séchés à 50-60 °C dans une étuve ventilée, puis broyés et homogénéisés dans un micro-démembreur (Mikro-Dismembrator S, Sartorius, Germany) pour obtenir une fine poudre. Une masse de 20 mg de cette poudre homogénéisée est disposée dans un flacon HS, avec addition de 20 mL d’eau et 10 µL de méthanol. L’analyse MHE-GC a été réalisée par trois injections séquentielles en HS à partir des flacons échantillon et étalon. Les pics chromatographiques ont été inféodés à trois groupes : monoterpènes, diterpènes et composés oxygénés (composés aromatiques et terpènes alcools). Les pics des groupes de monoterpènes et diterpènes ont été quantifiés par les étalons β-pinène et limonène, alors que le groupe des composés oxygénés a été quantifié par l’étalon

trans-anéthol. Les conditions opératoires pour l’analyse GC-MS sont comme suit : gaz vecteur

(He), débit d’écoulement (1,0 mL/min, écoulement constant), rapport split (1:25), température d’entrée (280 °C), volume d’injection (0,5 µL), température de la ligne de transfert (280 °C), température de la source MS (200 °C), énergie d’ionisation (+70eV), plage de balayage (40-250 m/z), colonne GC J&W: ZB-5HT, 20 m X 0,18 mm X 0.18 µm, programme

71 de température dans le four: 50 °C (0,5 min), 105 °C à 15 °C/min, 180°C à 30 °C/min et enfin 250 °C à 10 °C/min(1min).

2.1.3. Analyse GC-MS des huiles essentielles de P. scoparius obtenues

Les EsO obtenues par hydrodistillation des tiges de la plante fraîche (FP) et sèche (DP) sont analysés par GC-MS (Figure 25). Des solutions des huiles essentielles à 1% (v/v) diluées dans de l’hexane ont été injectées. Les solutions des standards suivants: pinène, β-pinène, α-phellandrène, α-terpinène, p-cymène, limonène, γ-terpinene et carvone ont été préparées dans de l’hexane pur à une concentration de 200 ppm. Le chromatographe gazeux GC Thermo Trace GC Ultra (Thermo Fisher Scientific, USA) équipé d’une colonne capillaire en silice fondue ZB-5HT (20 m X 0,18 mm X 0,18 µm) couplé à un spectromètre de masse Thermo DSQ II (Thermo Fisher Scientific, USA). La température a été programmée de 50 °C (1 min), 150 °C à 3 °C/min et à 5°C/min jusqu’à 260 °C avec un laps de temps d’une minute. L’hélium (He) a été utilisé comme gaz vecteur (0,6 mL/min), injection en mode split (1:25), température de l’injecteur de 280 °C. Le spectromètre de masse en mode EI à 70 eV. L’identification des composés est basée sur l’appariement de leurs spectres de masses avec ceux de la bibliothèque spectrale du NIST (NIST MS Search 2,0, 2005) ainsi que la comparaison de leurs indices de rétention avec les indices de la base de données NIST. Les indices de rétention ont été calculés avec la formule de Van den Dool et Kratz. La colonne et la méthode ont été transférées au chromatographe Thermo Focus GC, muni d’un détecteur à ionisation de flamme (FID) pour le dosage quantitatif. 2.1.4. Analyse de l’huile essentielle par chromatographie bidimensionnelle GCxGC L’analyse GCxGC a été réalisée à l’aide d’un système chromatographique 2D Agilent 7890N (Agilent, USA), équipé d’un modulateur de débit. Le détecteur utilisé est le FID à 250 °C. Le programme de température du four a été de 70 °C (2min) – 7 °C/min – 240 °C (15 min). La température d’entrée a été de 250 °C. Le dispositif de colonnes à deux dimensions était composé d’une première colonne composée d’un liquide ionique (4MPyC6, 30m x 0,25 mm x 0,2 MKM; dite colonne 1) et d’une seconde colonne HP-5 (5m x 0,25 mm x 0,2 MKM, dite colonne 2). L’hélium de pureté analytique a été utilisé comme gaz vecteur. L’échantillon a été injecté en utilisant le mode split 1:100. Les vitesses d’écoulement pour les colonnes 1 et 2 étaient respectivement de 1 et 25 mL/min avec un temps de modulation correspondant à 1,4 s.

72 2.1.5. Analyses GC-MS et GCxGC des huiles essentielles de P. scoparius

2.1.5.1. Analyse chromatographique par GC-MS

L’identification chromatographique des EsO issues de l’extraction par hydrodistillation à partir des tiges (EsOS) et des fleurs (EsOF) de P. scoparius a été effectuée à l’aide d’un système GC-MS Agilent 7000 (Agilent, USA), équipé d’une colonne capillaire en silice fondue HP-ms (30 m X 0,25 mm X 0,25 µm). La température a été programmée de 60 °C (5 min), 150 °C à 5 °C/min puis à une vitesse de 15 °C/min jusqu’à 240 °C avec un laps de temps de 10 min. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur (1 mL/min), injection en mode split (1:200) avec une température de l’injecteur de 280 °C. Le spectromètre de masse est mis en mode EI à 70 eV, avec une plage de balayage de 40-400 m/z. L’identification des composés a été basée sur l’appariement de leurs spectres de masse avec ceux de la bibliothèque spectrale du NIST 11 (NIST MS Search 2,0, 2005) ainsi que sur la comparaison de leurs indices de rétention avec les indices de la base de données du NIST.

2.1.5.2. Analyse chromatographique par GCxGC

L’analyse GCxGC a été réalisée à l’aide d’un système chromatographique 2D Agilent 7890N (Agilent, USA), équipé d’un modulateur de débit. Le détecteur utilisé est le FID à 250 °C. Le programme de température du four a été de 90 °C (3 min) - 8 °C/min - 240 °C (15 min) et la température d’entrée de 250 °C. Le dispositif bidimensionnel 236 est composé d’une colonne customisée contenant un liquide ionique (N-Propyl4MPy, 25 m X 0,25 mm X 0,2 µm; identifiée comme colonne 1) et d’une HP-5 (5 m X 0,25 mm X 0,2 µm, identifiée comme colonne 2). L’hélium de pureté analytique a été utilisé comme gaz vecteur. L’échantillon a été injecté en mode split 1:100. Les vitesses d’écoulement pour la colonne 1 et la colonne 2 étaient respectivement de 1 et 25 mL/min et un temps de modulation de 1,5 s.