Effets anti-cancéreux de solutions salines activées par plasma froid Résumé de l’article 2

La composition complexe des milieux de culture impacte fortement sur la composition finale de ces milieux après exposition au plasma. Il est difficile de prévoir et de contrôler la composition des PAM, de plus ces milieux enrichis en nutriments (acides aminés, protéine) ne sont pas injectables à l’homme, ce qui rend donc leur utilisation peu pertinente pour une application en clinique. C’est pour cette raison que nous avons par la suite évalué le potentiel anti-cancéreux de solutions dites physiologiques, c’est-à-dire isotonique, parfaitement toléré par les cellules, injectable à l’homme et donc transposables pour des applications en clinique. Deux solutions salines ont été utilisées pour cette étude : le tampon phosphate salin sans calcium et sans magnésium (PBS) et le chlorure de sodium à 0,9 % (NaCl). Sur la base des expériences effectuées précédemment, nous avons choisi un temps d’exposition de 120 secondes du PBS et du NaCl. Dans ces conditions une évaporation maximale de 20% des liquides lors de l’exposition au jet de plasma est observée. Les effets de ces solutions activés par plasma (P-A PBS et P-A NaCl, pour plasma-activated PBS et NaCl) ont été évalué sur deux lignées cellulaires : les cellules HCT 116-GFP utilisées précédemment et les cellules chimio- résistantes de carcinome ovarien, transduites pour exprimer la GFP et la Luciférase, SKOV-3- GFP-Luc (lignée doublement transduite avec la Luciférase pour des application in vivo) (Coustets et al. , 2020) dans le but de voir si la réponse au traitement est lignée cellulaire dépendante.

Nous avons, dans un premier temps, vérifié qu’une incubation de 4 heures des sphéroïdes dans du PBS ou du NaCl non exposés au jet de plasma n’avait pas d’effet sur leur croissance. Nous avons également vérifié que l’augmentation d’osmolarité du PBS et NaCl due à l’évaporation lors de l’exposition au jet de plasma, reportée précédemment (Article 1, tableau 1) ainsi que dans l’article 2 (Figure 4), n’avait pas d’effet sur la croissance des sphéroïdes. Pour ce faire, les solutions de PBS et de NaCl ont été exposées au flux d’Hélium sans mise sous tension, afin d’obtenir une évaporation similaire à celle obtenue lors de l’exposition au jet de plasma. Les courbes de croissance des sphéroïdes témoins incubés dans les différents milieux (DMEM, PBS, NaCl, PBS Hélium et NaCl Hélium) sont présentées en figure 38. Les courbes montrent que l’incubation de 4 heures dans les solutions non exposées au jet de plasma ou exposées au flux d’hélium seul n’affectent pas de façon significative la croissance des sphéroïdes. Ainsi, les effets que nous observerons lors des traitements par P-A PBS et P-A NaCl pourront être attribués à l’exposition au jet plasma et non pas à l’incubation de 4 heures dans ces liquides ou

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à la variation d’osmolarité induite lors de l’exposition au jet de plasma. Ces expériences ont été effectuées uniquement sur les sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP.

Figure 38 : Influence des solutions PBS et NaCl non exposées au jet de plasma ou exposées au flux d’hélium seul sur la croissance des sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP. Les solutions de PBS et de NaCl sont exposées

au flux d’hélium (sans mise sous tension) pendant 4 minutes, temps nécessaire pour avoir une évaporation équivalente à celle obtenue lors d’une exposition de 2 minutes au jet de plasma froid. À la fin de l’incubation de 4 heures, les sphéroïdes sont rincés puis transférer dans du nouveau milieu de culture DMEM complet (sans pyruvate) et remis en culture à 37°C pour un suivi de croissance sur 7 jours. Les courbes de croissance sont obtenues à partir de la mesure de l’aire de la fluorescence GFP (cellules viables) comme décrit dans le matériel et méthode section 8. N=1 expérience, n=6 sphéroïdes/condition, moyenne ± déviation standard.

Article 2 : Anti-cancer potential of two plasma-activated liquids : implication of long-lived reactive oxygen and nitrogen species. Elena Griseti, Nofel Merbahi, Muriel Golzio. Cancers

(2020) 12, 721.

Pour la suite des travaux de thèse, nous avons décidé de garder les paramètres optimisés avec les milieux de culture, soit une exposition au jet de plasma de 2 minutes et une incubation des sphéroïdes avec le P-A PBS et le P-A NaCl de 4 heures à 37°C. Nous avons montré que le P-A PBS tue plus efficacement les cellules cancéreuses car la couronne de cellules affectées par le traitement qui se détachent à 24 heures est plus épaisse avec le P-A PBS qu’avec le P-A NaCl, et pour les deux lignées. La différence est néanmoins moins marquée pour les sphéroïdes de cellules SKOV-3-GFP-Luc. Nous avons utilisé de l’iodure de propidium (1 µM), intercalant de l’ADN fluorescent rouge qui rentre uniquement dans les cellules dont l’intégrité membranaire est affectée, pour visualiser en temps réel la population de cellules mortes. Des cinétiques de mort cellulaire ont été tracées et ont confirmé les résultats obtenus sur les courbes de croissance des sphéroïdes : la population de cellules mortes (PI positives) augmente plus rapidement avec le P-A PBS, et se situe dans les couches plus profondes du sphéroïde.

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Par la suite, nous avons vérifié si les différences observées entre le P-A PBS et le P-A NaCl, en termes de toxicité et de cinétique de mort cellulaire, sont dues à l’enrichissement en espèces réactives de l’oxygène et de l’azote (RONS) des deux solutions pendant l’exposition au plasma. Comme dit dans l’introduction, parmi les RONS qui sont produites dans les PAM et PAL, le peroxyde d'hydrogène (H2O2), le nitrite (NO2-) et le nitrate (NO3-) semblent être principalement responsables des effets cytotoxiques et génotoxiques attribués. Ainsi, nous avons dosé le H2O2, le NO2- et le NO3- directement après l’exposition de 2 minutes au jet de plasma des solutions. Des quantités plus faibles des trois espèces ont été détectées dans le NaCl par rapport au PBS. De plus, une acidification du NaCl est notable après l’exposition au jet de plasma tandis que le PBS, solution tamponnée, ne présente pas de modification de pH.

Enfin, le H2O2, le NO2- et le NO3- ont été ajoutés, seuls ou combinés,dans les solutions de PBS et de NaCl afin de traiter les sphéroïdes et d’étudier l’effet de chacune des espèces sur la croissance et donc leur implication dans la toxicité du P-A PBS et du P-A NaCl. Ces expériences nous ont permis de mettre en évidence que la mortalité engendrée dans les sphéroïdes correspond à une réponse RONS dose-dépendante et que le H2O2 et le NO2- sont nécessaires pour affecter la croissance des sphéroïdes HCT 116-_{GFP aussi efficacement que le P-A PBS et} le P-A NaCl. En revanche, le H2O2 seul suffit à affecter les sphéroïdes de cellules SKOV-3- GFP-Luc de la même façon que les PAL.

Il est important de noter ici que la variable pH n’a pas été prise en compte dans ces expériences. En effet, lorsque les RONS ont été ajouté au NaCl, nous n’avons pas acidifié la solution afin de mimer les propriétés du P-A NaCl. Nous avons donc par la suite effectué cette expérience, en aval de la publication de l’article 2, sur les sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP et aucune différence n’a été observée entre le NaCl additionné des RONS à pH 6,5 et le NaCl additionné des RONS acidifié à pH 4 (Figure 39).

Figure 39 : Influence du pH extracellulaire sur la cytotoxicité du NaCl enrichies en RONS. Courbes de

croissance des sphéroïdes HCT 116-GFP incubés dans du NaCl (témoin), du P-A NaCl, et du NaCl contenant 515 µM de péroxyde d’hydrogène ± nitrite (160 µM) ± nitrate (180 µM) pH 6,5 ou pH 4. N=1 expérience, n=8 sphéroïdes, moyenne ± déviation standard.

Jours post traitement

C ro is s a n c e r e la ti v e d e s s p h é ro ïd e s (% d u v o lu m e d e s c o n tr ô le N a C l) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 NaCl P-A NaCl H2O2 + NO2- + NO3- H2O2 + NO2- + NO3-pH 4

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5. Article 2 : Anti-cancer potential of two plasma-activated liquids : implication of long-