Partie I : Évaluation des effets anti-cancéreux de solutions salines activées par plasma froid
7. Bilan et discussion des résultats (partie I)
Les mécanismes impliqués dans la mort cellulaire des sphéroïdes, induite par traitement avec du DMEM activé par plasma (P-A DMEM), ont été élucidés. Il a été mis en évidence que la mort par apoptose des cellules HCT 116-WT du sphéroïde est induite par une chute de l’ATP intracellulaire des cellules qui conduit à un stress oxydatif mitochondrial (Figure 42). En effet, la déplétion en ATP induite par le traitement témoigne d’une dysfonction dans la respiration cellulaire contrôlée par les mitochondries. L’accumulation de ROS dans les cellules entraîne une augmentation du transport des électrons par la chaîne respiratoire des mitochondries (Lablanche, 2009; Tiwari et al. , 2002). C’est cette augmentation d’activité mitochondriale (mise en évidence par la production de l’ion superoxyde dans l’article 1) qui est à l’origine de deux phénomènes cellulaires : des altérations des pores de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) et le relargage du cytochrome c dans le cytoplasme. L’altération des mPTP entraîne un découplement de l’oxydation phosphorylante à l’origine du déficit énergétique cellulaire (déplétion en ATP).
Figure 42 : Chronologie des évènements induits par le traitement milieu de culture DMEM activé par plasma froid entraînant la mort cellulaire dans les sphéroïdes de cellules HCT 116-WT.
Nous avons ensuite validé l’utilisation de la lignée cellulaire HCT 116 exprimant la protéine fluorescente GFP. En effet, ces cellules sont également sensibles au traitement par P- A DMEM, et que plus le temps d’exposition du DMEM au plasma est élevé, plus la croissance des sphéroïdes est affectée, de la même façon qu’avec la lignée WT. De plus, nous avons validé l’utilisation du marqueur fluorescent GFP comme outil pour discriminer les cellules mortes des cellules vivantes, facilitant ainsi les mesures pour les suivis de croissance (pas de biais induit par l’expérimentateur, mesures manipulateurs indépendantes).
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Nous avons, par la suite, évalué les effets de deux solutions salines, le PBS et le NaCl, exposés au jet de plasma sur des sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP et de cellules de carcinome ovarien SKOV-3-GFP-Luc. Nous avons décidé d’utiliser ces deux lignées cellulaires afin de voir si la réponse au traitement est lignée cellulaire dépendante. De plus, ces deux lignées ont été utilisées pour les investigations in vivo (Résultats-Partie III), sur deux modèles de tumeurs différents (sous-cutanée ou intrapéritonéale) et permettent ainsi d’évaluer l’efficacité de différents protocoles d’injection de liquides activés par plasma (intra-tumorale ou intrapéritonéale).
Le P-A PBS tue plus efficacement les cellules et pénètre plus rapidement dans les couches du sphéroïde que le P-A NaCl, bien que les deux solutions induisent une mort par apoptose des cellules. Cette différence d’efficacité entre le P-A PBS et le P-A NaCl est d’autant plus prononcée pour les sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP.
Dans le but d’affecter plus fortement les cellules et jusqu’au cœur du sphéroïde, nous avons par la suite proposé des incubations successives dans le P-A PBS ou le P-A NaCl des sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP. Ces traitements successifs par P-A NaCl ont pour effet de ralentir la croissance des sphéroïdes. Au contraire, lorsque les sphéroïdes subissent des traitements successifs avec du P-A PBS, un détachement concentrique des cellules après chaque traitement est observé, il y a donc un effet additif. Ainsi, il est possible d’éradiquer la totalité des sphéroïdes et d’affecter les couches profondes d’un modèle en trois dimensions avec des traitements répétés par P-A PBS.
L’étude des propriétés physico-chimiques de ces deux solutions après exposition au jet de plasma a montré que les variations d’osmolarité étaient similaires pour le PBS et le NaCl. En revanche, du fait de sa nature non-tamponné, le NaCl subit une forte acidification après l’exposition au plasma. Cette acidification du NaCl suite à l’exposition du plasma avait déjà été décrite auparavant et expliquée par la génération d’acide nitreux (HNO2) et d’acide nitrique (HNO3) dans la solution (Rumbach et al. , 2013). L'activité des RONS ou leur pénétration au sein des sphéroïdes pourraient être altérées dans un environnement acide, ceci pourrait expliquer l’efficacité moindre du P-A NaCl par rapport au P-A PBS. Cependant, l'acidification, qui a déjà été considérée comme responsable d'une cytotoxicité plus élevée due à la génération de peroxynitrite (Julák et al. , 2018), n'a pas joué un rôle majeur dans les traitements impliquant le P-A NaCl dans notre étude. Ainsi, des investigations supplémentaires devraient être réalisées afin de comprendre les processus de génération des espèces dans cette solution dans le but de comprendre au mieux les différences observées entre le P-A PBS et le P-A NaCl.
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En revanche, la différence d’efficacité entre le P-A PBS et le P-A NaCl peut être attribuée à la plus forte production de peroxyde d’hydrogène H2O2, de nitrite NO2- et de nitrate NO3- dans le PBS après exposition au jet de plasma. Ces fortes concentrations accélèrent la cinétique de mort cellulaire permettant ainsi d’affecter plus de cellules, dans les couches plus profondes du sphéroïde. Nous avons également démontré que le H2O2 et le NO2- sont responsables des dommages causés aux cellules lors de l’incubation avec le P-A PBS, en accord avec les travaux de Girard et ses collaborateurs, effectués sur cellules en 2D (Girard et al. , 2016), et de Privat et ses collaborateurs sur sphéroïdes de cellules de glioblastome (Privat-Maldonado et al. , 2018). De façon inattendu, le H2O2 seul contribue à l’effet cytotoxique duP-A NaCl. Afin de valider l’implication de ces RONS dans la cytotoxicité du PBS et du NaCl activés par plasma, des expériences supplémentaires devraient être réalisées afin d'évaluer la réversibilité de l'effet cytotoxique des RONS en utilisant des inhibiteurs tels que l'acide ascorbique ou le pyruvate. Ceci nous permettrait de conclure quant à l’implication de ces RONS dans l’efficacité des traitements par PAM ou PAL ainsi que dans les processus de mort cellulaire induits. Dans le cas où l’utilisation de ces inhibiteurs ne reverserait pas totalement l’effet cytotoxique et induirait une mort cellulaire différente, ceci pourrait montrer que d’autres variables rentrent en jeu.
Cette partie I a permis de mettre en évidence le potentiel anti-cancéreux de deux solutions salines, le tampon phosphate salin et le chlorure de sodium 0,9%, activés par plasma. J’ai mis en évidence que le tampon phosphate salin est plus efficace que le chlorure de sodium 0,9% en termes de mortalité induite et de génération de RONS après exposition au jet de plasma. Nous avons donc fait le choix de travailler avec ce liquide activé par plasma pour la suite des travaux de thèse. Afin d’augmenter l’efficacité de ces solutions activées par plasma sur des modèles en trois dimensions comme le sphéroïde in vitro ou les tumeurs in vivo, des traitements successifs peuvent être réalisés. Néanmoins, l’administration répétée in vivo en clinique pour le traitement des tumeurs peut être considérée comme invasive. C‘est pourquoi, il est impératif/nécessaire de combiner les traitements par liquides activés par plasma avec d’autres méthodes afin d’améliorer leur délivrance et in fine potentialiser leurs effets. C’est dans ce contexte que nous avons évalué l’effet combiné des champs électriques pulsés avec le tampon phosphate salin in vitro sur les sphéroïdes de cellules HCT 116-GFP (partie II).
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