Effet du lumicanne recombinant sur la migration et l’invasion des cellules de mélanome

pro-apoptotique classique : la doxorubicine (1 µM, diluée dans le DMSO) (Zwelling et coll.

1991). Comparé au contrôle contenant du DMSO (figure 44 A, G et M), la morphologie nucléaire est modifiée pour les cellules incubées en présence de doxorubicine. En effet, elles présentent après 2 heures d’incubation, une condensation périnucléaire de la chromatine (figure 44 B) qui augmente avec le temps et qui est associée à une diminution du nombre de cellules adhérentes (figure 44 H et N). En ce qui concerne les cellules A375 incubées sur les lamelles de verre (figure 44 C, I et O) ou en présence de collagène de type I (figure 44 D, J et P), de fibronectine (figure 44 E, K et Q) comme en présence de lumicanne (figure 44 F, L et R), nous n’avons observé aucune variation de leur morphologie nucléaire au bout de 24 heures d’incubation. Le lumicanne n’induit donc pas l’apoptose des cellules de mélanome humain A375.

5- Effet du lumicanne recombinant sur la migration et l’invasion des cellules de mélanome

Afin de coloniser les tissus sains, les cellules cancéreuses doivent migrer au travers d’un ensemble de matrices extracellulaires et de membranes basales. Nous avons, de ce fait, étudié l’effet in vitro du lumicanne sur la migration et l’invasion des cellules de mélanome de souris B16F1 et de mélanome humain A375.

Temps d’incubation A

A BB CC DD EE FF

G

G HH II JJ KK LL

N N M

M OO PP QQ RR

50 µm 50 µm

2h

4h

24h

Verre Collagène I

DMSO Doxorubicine Fibronectine Lumicanne

Figure 44 : Le lumicanne n’induit pas l’apoptose des cellules A375. Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles de verre tapissées ou non par 10 µg de protéines matricielles (lumicanne, collagène de type I, fibronectine) ou ensemencées sur des lamelles de verres non tapissées et incubées dans du DMEM contenant soit du DMSO (à la concentration finale de 0,1 %) soit de la doxorubicine (solubilisée dans le DMSO). Les noyaux cellulaires sont colorés au Hoechst 33342 après les temps d’incubation indiqués au niveau de la marge droite.

Contrairement à la doxorubicine, le lumicanne n’induit pas l’apoptose des celllules A375. Les cellules en apoptose sont indiquées par des flèches blanches.

5.1- Effet du lumicanne recombinant sur la migration des cellules de mélanome

Les cellules sont ensemencées sur les membranes de polycarbonate des Transwell^® recouvertes par différentes quantités de lumicanne recombinant. Après 24 heures d’incubation, les cellules sont soit colorées au May-Grünwald-Giemsa soit colorées au violet cristal. Les figures 45 et 46 correspondent aux photographies de microscopie optique des cellules B16F1 et A375 fixées sur la face inférieure de la membrane, c’est-à-dire des cellules qui ont migré au travers des divers tapis protéiques. D’après ces photographies, nous avons observé une distribution homogène des cellules ayant migré. De ce fait, les cellules ayant migré ont pu être comptées. La quantification des cellules ayant migré est représentée par les histogrammes des figures 47 et 48. Bien qu’en présence de BSA on observe une légère diminution de la migration des cellules B16F1, la figure 47 montre une diminution significative de la migration des cellules B16F1 de 50 % pour 10 µg de lumicanne déposé par Transwell^® par rapport à son contrôle BSA. On observe également une diminution de la migration des cellules A375 de 55 % pour 10 µg de lumicanne déposés par rapport à son contrôle BSA (figure 48). In vitro, le lumicanne est donc capable de diminuer la migration des cellules de mélanome de souris B16F1 et de mélanome humain A375.

5.2- Effet du lumicanne recombinant sur l’invasion des cellules de mélanome

Les cellules sont ensemencées sur la membrane de polycarbonate des Transwell^® recouverte de Matrigel^® additionné de différentes quantités de lumicanne recombinant.

Comme pour la mesure de la migration, après 24 heures d’incubation, les cellules sont colorées soit au May-Grünwald-Giemsa soit au violet cristal, photographiées puis comptées.

La BSA n’ayant aucune influence significative sur la migration cellulaire, nous ne l’avons pas utilisée comme contrôle pour l’étude de l’invasion. Lorsque les cellules sont déposées sur 10 µg de lumicanne recombinant/Transwell^®, on observe une diminution de l’invasion de la membrane basale artificielle de 80 % pour des cellules B16F1 et de 23 % pour les cellules A375 (figures 49 et 50).

(A) Témoin

100 µm

(B) 1 µg de BSA (C) 1 µg de lumicanne

(D) 10 µg de BSA (E) 10 µg de lumicanne

Figure 45 : Observation des cellules B16F1 en microscopie optique. (A) Migration en absence de tapis protéique, (B) au travers d’un filtre de Transwell® tapissé par 1 µg de BSA, (C) par 1 µg de lumicanne, (D) par 10 µg de BSA et (E) par 10 µg de lumicanne. Les cellules sont colorées au May-Grünwald-Giemsa. Les pores de la membrane des Transwell^® sont visibles, leur diamètre est de 8 µm.

(A) Témoin (B) 1 µg de lumicanne

^{50 µm}

(C) 5 µg de lumicanne (D) 10 µg de lumicanne

Figure 46 : Observation des cellules A375 en microscopie optique. (A) Migration en absence de tapis protéique, (B) au travers d’un filtre de Transwell® tapissé par 1 µg de lumicanne, (C) par 5 µg de lumicanne et (D) par 10 µg de lumicanne. Les cellules sont colorées au violet cristal.

0 100 200 300 400 500 600 700

C ôl L 1 L 10

BSA Lumicanne Témoin

Quantité de protéine déposée (µg/Transwell^®) 0 1 10

* (- 50 %)

Nombre moyen de cellules ayant migré par champ d’observation

Figure 47 : Effet du lumicanne sur la migration des cellules de mélanome de souris B16F1. 50000 cellules sont déposées sur la face supérieure de la membrane des Transwell^® non tapissée ou tapissée par 1 ou 10 µg de BSA ou de lumicanne recombinant. Après 24 heures de migration, les cellules sont colorées au May-Grünwald-Giemsa. Les cellules ayant migré sont comptées dans les 5 champs d’observation photographiés/membrane. Chaque condition à été réalisée en triplicata. L’histogramme représente la moyenne des cellules ayant migré/champs d’observation en fonction de la quantité de protéine déposée/Transwell^®. (∗

p<0,05).

0 50 100 150 200 250

* (-55 %)

Nombre moyen de cellules ayant migré par champ d’observation

Témoin BSA Lumicanne

0 1 5 10 Quantité de protéine déposée (µg/Transwell^®)

Figure 48 : Effet du lumicanne sur la migration des cellules de mélanome humain A375.

Cette étude a été réalisée dans les mêmes conditions que pour la migration des cellules de mélanome B16F1, à la différence que les cellules de mélanome A375 ont été colorées au violet cristal. (∗ p<0,05).

0 Nombre moyen de cellules ayant migré par champ d’observation

Figure 49 : Effet du lumicanne sur l’invasion des cellules de mélanome de souris B16F1 au travers d’une membrane basale artificielle de Matrigel^®. 50000 cellules sont déposées sur la face supérieure de la membrane des Transwell^® tapissée par 10 µg de Matrigel^® additionné ou non par 1 ou 10 µg de lumicanne recombinant. La quantification des cellules ayant migré est réalisée comme lors de l’étude de la migration des cellules B16F1. (∗∗

p<0,01). Nombre moyen de cellules ayant migré par champ d’observation

)

0 1 10 Matrigel^® (µg/Transwell^®) 10 10 10

Figure 50 : Effet du lumicanne sur l’invasion des cellules de mélanome humain A375 au travers d’une membrane basale artificielle de Matrigel^®. Cette étude a été réalisée dans les mêmes conditions que pour l’invasion des cellules B16F1 à la différence que les cellules A375 ont été colorées au violet cristal. (∗ p<0,05).

6- Effet du lumicanne recombinant sur l’expression et l’activité des métalloprotéinases