Effet du lumicanne sur la formation des adhésions focales

Lors de l’adhésion à la matrice extracellulaire, certaines intégrines s’agrègent au niveau de structures périmembranaires appelées adhésions focales. Les adhésions focales sont des complexes multi-protéiques, regroupant les intégrines, la paxilline, la vinculine, la kinase d’adhésion focale (FAK), et d’autres molécules qui servent de lien entre le cytosquelette d’actine et les composants de la matrice extracellulaire (Geiger et coll. 2001). De plus, la paxilline et la vinculine sont connues comme interagissant avec le domaine cytoplasmique de la sous-unité d’intégrine β1 (Katoh et coll. 1995). Le lumicanne interagissant avec les cellules A375 via la sous-unité d’intégrine β1 et entraînant une désorganisation du cytosquelette d’actine, nous avons étudié l’effet du lumicanne sur la formation des complexes d’adhésion focale.

Pour cela, les cellules ont été immunomarquées par des anticorps anti-paxilline ou anti-vinculine accompagnés d’un marquage des filaments d’actine à la phalloïdine. Après 24 heures d’incubation sur le verre, le collagène de type I ou la fibronectine, nous avons observé de nombreux points correspondants aux co-immunomarquages entre la paxiline et l’actine (figure 69 A, B et C) ou entre la vinculine et l’actine (figure 69 E, F et G), soit la formation de nombreux points d’adhésion focale. Par contre, en présence de lumicanne, que ce soit en fonction du co-immunomarquage de la paxilline avec l’actine (figure 69 D) ou de la vinculine avec l’actine (figure 69 H), nous avons observé une diminution de l’immunomarquage suggérant une diminution du nombre de points focaux.

La kinase d’adhésion focale, FAK, est une kinase cruciale dans l’activation de la cascade d’évènements intracellulaires initiés par les adhésions focales et joue un rôle important dans la migration cellulaire. L’activation de FAK par les intégrines entraîne une autophosphorylation de FAK au niveau de sa tyrosine 397 (Parsons et coll. 2000). L’effet du lumicanne sur la phosphorylation de la tyrosine 397 a donc été étudié. La localisation de la tyrosine 397 phosphorylée de FAK (pY397FAK) (figure 69 I, J K et L) reflète celle des complexes d’adhésion focale. Après visualisation par immunofluorescence, nous avons observé, en présence de lumicanne, une diminution significative de l’immunomarquage et donc de la phosphorylation de FAK à la périphérie membranaire suggérant une diminution de l’activation de la protéine FAK contrairement à ce que nous avons obtenu en présence des autres substrats (figure 69 L).

L’ensemble des ces résultats indiquent que la redistribution des intégrines induite par le lumicanne peut être due à une profonde réorganisation du cytosquelette et des points focaux

par les cellules de mélanome A375, le tout concourant à une diminution du phénotype migratoire de ces cellules.

A B C D

A B C D

A B C D

Paxilline Fibres de stress d’actine

E F G H

Figure 69 : Effet du lumicanne sur la formation des complexes d’adhésion focale. Les cellules A375 sont déposées sur divers substrats de la MEC et incubées 24 heures à 37°C.

Elles sont ensuite fixées et immunomarquées par les anticorps anti-paxilline, anti-vinculine ou anti-pY397FAK puis incubées avec l’anticorps secondaire anti-IgG1 couplé à l’Alexa Fluor^®488. Les filaments d’actine sont marqués à la phalloïdine couplée à l’Alexa Fluor^®568.

L’observation a été réalisée en microscopie laser confocale. Les points focaux sont indiqués par des flèches (A-H) et par les spots blancs (I-L).

Verre Collagène I Fibronectine Lumicanne

Vinculine Fibres de stress d’actine

pY397FAK

5 µm

I J K L

E F G H

E F G H

I J K L

5 µm

Discussion

Le mélanome est le cancer cutané le plus grave en raison d’un potentiel métastatique élevé et d’un pronostic sévère. Il s’agit d’une tumeur maligne qui se développe aux dépens des mélanocytes. Au cours de la progression du mélanome, les cellules tumorales doivent franchir la jonction dermo-épidermique qui sépare l’épiderme du derme, et envahir le derme, son principal site de propagation. L’envahissement de la jonction dermo-épidermique et du tissus dermique par les cellules tumorales est un processus complexe qui implique plusieurs étapes. Les cellules doivent d’abord adhérer aux constituants matriciels de la membrane basale, les dégrader en sécrétant des enzymes protéolytiques, et enfin, migrer pour envahir le derme puis métastaser (Ntayi et coll. 2004 ; Stetler-Stevenson et coll. 1993).

Les petits protéoglycannes riches en leucine (SLRPs), dont la famille comprend entre autres, la décorine, le biglycanne et le lumicanne, représentent des constituants importants de la matrice extracellulaire dermique (Iozzo 1998 ; Vuillermoz et coll. 2005). Au cours de précédents travaux, nous avons démontré que le lumicanne est impliqué dans le contrôle de la croissance et de l’invasion des cellules de mélanome de souris B16F1 et que ce SLRP peut être considéré, de manière identique à la décorine, comme un composant de la matrice extracellulaire doté de propriétés anti-tumorales (Vuillermoz et coll. 2004).

L’objectif de ce travail était d’étudier le(s) mécanisme(s) d’action anti-tumoral du lumicanne sur les cellules de mélanome.

Dans une première partie, nous avons mis au point une méthode de production de lumicanne humain recombinant.

Dans une seconde partie, nous avons étudié les effets biologiques induits par le lumicanne sur les cellules de mélanome et avons débuté des travaux concernant la détermination de la séquence peptidique active du lumicanne.

Enfin, dans la dernière partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à la caractérisation du (des) récepteur(s) du lumicanne présent(s) à la surface des cellules de mélanome.

Dans de nombreux types de cancer, le lumicanne peut-être exprimé soit par les cellules cancéreuses elles-mêmes soit au niveau du stroma péritumoral, soit par les deux. En fonction de la localisation de son expression ou en fonction du type de cancer, le lumicanne peut-être impliqué dans des phénomènes opposés.

En effet, dans le cas du cancer pancréatique, les patients, dont les cellules cancéreuses expriment du lumicanne, tendent à avoir une espérance de vie plus longue que les patients dont les cellules cancéreuses n’en expriment pas. Inversement, les patients pour lesquels le lumicanne est exprimé au niveau du stroma péritumoral, ont une durée de vie plus courte que les patients pour lesquels le lumicanne n’est pas exprimé au niveau du stroma (Ishiwata et coll. 2007).

Dans le cas du carcinome mammaire, il a été montré que l’expression de lumicanne au niveau du stroma péritumoral est associée à un grade tumoral avancé (Leygue et coll. 1998 et 2000) et qu’une diminution de l’expression de lumicanne est associée à une rapide progression ainsi qu’à un faible taux de survie du patient (Troup et coll. 2003).

En ce qui concerne le mélanome, des études ont montré que le lumicanne pouvait être exprimé au niveau du stroma péritumoral ainsi que par certains types de cellules de mélanome (Brézillon et coll. 2007 ; Sifaki et coll. 2006). Lors d’une étude antérieure, des cellules de mélanome de souris B16F1 ont été transfectées de manière à exprimer du lumicanne. Nous avons observé pour ces cellules, in vitro, une inhibition de la croissance tumorale et in vivo, une inhibition du potentiel métastatique (Vuillermoz et coll. 2004) or le mécanisme d’action anti-tumorale du lumicanne restait à élucider.

Afin de produire le lumicanne recombinant nécessaire à notre étude, nous avons sous cloné l’ADNc du lumicanne humain dans le plasmide pQE30. Les 16 premiers acides aminés du peptide signal supposé ont été substitués, lors de l’insertion de l’ADNc du lumicanne humain entre les sites KpnI et SmaI du plasmide pQE30, par 18 acides aminés appartenant à ce dernier et comprenant une séquence codant 6 résidus histidine. Le plasmide d’expression résultant a été désigné sous le nom de pQE30-HLUM.

Les bactéries JM109(DE3) ont été transformées par le plasmide d’expression pQE30-HLUM. Les bactéries transformées ont été cultivées en présence d’IPTG. Bien que l’expression du lumicanne recombinant soit détectée à la fois dans les cultures bactériennes induites et non induites par l’IPTG, nous avons remarqué qu’en présence d’IPTG la quantité de lumicanne produite était doublée.

La protéine recombinante flanquée des 6xHis à son extrémité N-terminale a été purifiée, après solubilisation des corps d’inclusion par de l’urée 8 M, par chromatographie

d’affinité sur une colonne de Ni-NTA. Les 6xHis permettent, par chélation des ions Ni²⁺, la rétention de la protéine recombinante dans la colonne. L’analyse en gel de polyacrylamide en présence de SDS de la fraction éluée a révélé une bande unique de 38 kDa correspondant à la taille théorique de la protéine cœur du lumicanne. L’authenticité de la protéine purifiée a été confirmée par Western blotting utilisant un anticorps polyclonal anti-lumicanne, ceci pour une culture bactérienne de départ de 100 mL et de 1 L. Lorsque nous sommes passés à une culture de 2 L, l’analyse de la fraction éluée a mis en évidence une bande de 38 kDa de faible intensité suggérant soit que la totalité du lumicanne recombinant ne s’était pas entièrement fixée à la résine de Ni-NTA soit que les volumes des divers solutions et tampons utilisés n’était pas adaptés à l’extraction de la totalité du lumicanne recombinant produit. Sachant que la résine Ni-NTA peut fixer de 5 à 10 mg de protéine/mL, une optimisation des volumes des solutions et tampons à utiliser reste à déterminer pour permettre de traiter de plus grands volumes de culture bactérienne et donc de produire de plus importantes quantités de lumicanne recombinant. Pour 100 mL de culture bactérienne, nous avons pu obtenir entre 0,8 et 1,5 mg de protéine recombinante dont la masse moléculaire (38,8 kDa) et le point isoélectrique (6,43) sont similaires à ceux de la protéine cœur humaine native (38,4 kDa et pHi 6,16).

Une étude réalisée par Li et collaborateurs (2004) a montré que la MT1-MMP est capable de cliver du lumicanne extrait de cornée de bœuf (forme protéoglycannique) et du lumicanne produit dans un système procaryote (forme protéique). Nous avons réussi à reproduire cette digestion avec notre lumicanne recombinant, lui-même produit dans un système procaryote.

Une fois, le lumicanne recombinant produit en quantité suffisante, nous avons débuté l’étude du mécanisme d’action anti-tumoral induit par ce dernier.

Dans un premier temps, afin de déterminer le modèle de mélanome adéquat, plusieurs cellules ont été testées. Notre critère de sélection s’est basé sur l’expression ou non de lumicanne. Nous avons montré par Western blotting que les cellules de mélanome humain M3Da expriment du lumicanne. Nous avons également montré, par RT-PCR, l’expression d’ARNm du lumicanne par les cellules de mélanome HT144 (Brézillon et coll. 2007). Au contraire, certaines cellules de mélanome n’en expriment pas, c’est le cas des cellules de mélanome humain A375 et de souris B16F1 (Vuillermoz et coll. 2004). Pour étudier les effets du lumicanne sur l’invasion tumorale, nous avons utilisé comme modèle d’étude les cellules de mélanome de souris B16F1 et les cellules de mélanome humain A375 et HT144.

Avant d’entreprendre toutes études, nous voulions savoir si le lumicanne recombinant produit pouvait être toxique. Un test au MTT pratiqué n’a révélé aucune toxicité vis-à-vis des cellules A375 et a donc permis la suite de l’étude.

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par leur prolifération rapide. Dans notre étude, nous avons observé que le lumicanne ne modifie pas la prolifération des cellules A375.

Nous avons obtenu des résultats similaires avec des cellules B16F1 exprimant du lumicanne après transfection (Vuillermoz et coll. 2004). Cependant, pour d’autres types cellulaires, le lumicanne peut jouer un rôle anti-prolifératif. En effet, il a été montré que le lumicanne est capable d’inhiber la prolifération de cellules comme les cellules HEK 293 (cellules embryonnaires de rein humain) ou les kératocytes de souris (Ishiwata et coll. 2004 ; Vij et coll. 2004).

Certaines études ont révélé l’effet pro-apoptotique du lumicanne sur les cellules de mélanome de souris B16F1 (Vuillermoz et coll. 2004) ainsi qu’au niveau de la cornée de souris sur des fibroblastes embryonnaires et des kératocytes (Vij et coll. 2004). Cependant, lors de notre étude de l’apoptose, nous avons observé que l’intégrité du noyau cellulaire n’était pas perturbée lorsque les cellules A375 étaient cultivées sur des tapis protéiques réalisés à l’aide de molécules issues de la matrice extracellulaire comme la fibronectine, le collagène de type I ou même le lumicanne, contrairement à ce qui a été obtenu en présence de doxorubicine, un agent classique inducteur d’apoptose (Zwelling et coll. 1991) avec laquelle, après 2 heures d’incubation, on distingue une condensation périnucléaire de la chromatine.

De nombreuses études ont montré l’importance de l’interaction cellules-matrice extracellulaire dans l’invasion tumorale. Les chambres de Boyden modifiées type Transwell^® fournissent un modèle d’évaluation rapide de la migration et de l’invasion cellulaire in vitro.

Les membranes des Transwell^® ont été tapissées soit par du lumicanne seul soit par un mélange de lumicanne et d’une membrane basale artificielle de Matrigel^®. Nos résultats acquis avec ce modèle mettent en évidence une diminution significative de la migration et de l’invasion des cellules de mélanome B16F1 et A375 lorsque les membranes sont recouvertes de lumicanne. Bien que la souche B16F1 soit réputée peu invasive, nos études en Matrigel^® montrent que ces cellules sont tout à fait capables de traverser une membrane basale reconstituée in vitro. Cette inhibition des capacités migratoires et invasives des cellules tumorales pourrait expliquer, au moins partiellement, l’effet anti-tumoral de la surexpression de lumicanne que nous avons précédemment observé in vivo (Vuillermoz et coll. 2004).

La migration des cellules tumorales nécessite la dégradation des protéines de la matrice extracellulaire. Cette dégradation fait intervenir de nombreuses protéinases sécrétées, soit par la cellule tumorale elle-même, soit par les cellules environnantes. Dans nos études in vitro, nous avons constaté que le lumicanne ne modifie pas la sécrétion de la pro-MMP-2 ni n’a d’influence sur son activation. Une autre MMP, la MMP-9, susceptible d’être impliquée dans l’invasion tumorale, n’est pas exprimée, dans nos conditions de culture, par les cellules A375.

Nous avons poursuivi nos travaux par l’étude de l’expression de la MMP. La MT1-MMP a été identifiée comme activateur de la pro-MT1-MMP-2 (Sato et coll. 1994). De plus, la MT1-MMP exprimée à la surface des cellules cancéreuses est capable de dégrader la décorine et le lumicanne, permettant ainsi le rétablissement de la tumorogénicité (Li et coll. 2004). Elle est également capable de dégrader d’autres constituants de la matrice extracellulaire tels que les collagènes de types I, II et III, la fibronectine, la laminine et d’autres protéoglycannes (Sato et coll. 2005). Cette fonction de dégradation matricielle en fait une enzyme clé dans le processus d’invasion tumorale (Sato et coll. 2005 ; Hotary et coll. 2003). Nous avons mis en évidence que la MT1-MMP est exprimée sous sa forme inactive par les cellules A375 et que l’interaction avec le lumicanne n’a aucune influence sur son activation. Au total, l’inhibition de migration in vitro des cellules A375 observée sous l’effet du lumicanne ne paraît donc pas dépendre d’un effet inhibiteur sur l’expression ou l’activation des MMP 2 et 9 ni de la MT1–

MMP.

L’adhésion des cellules tumorales à la matrice extracellulaire représente une étape importante du processus migratoire. De ce fait, l’ensemble de nos études in vitro nous a permis d’émettre l’hypothèse que l’inhibition de la migration des cellules A375 et B16F1 pourrait passer par une augmentation de l’adhésion cellulaire induite par le lumicanne. Cette hypothèse a été confirmée pour un certain nombre de cellules de mélanome, non seulement pour les cellules A375 et B16F1, mais également pour les cellules HT144, pour lesquelles l’adhésion sur plastique est inférieure à celle observée en présence de lumicanne. De plus, après avoir déposé les cellules sur une quantité croissante de lumicanne, nous avons observé une augmentation dose-dépendante de l’adhésion des cellules A375 et B16F1.

Certaines régions riches en leucine, LRR, des SLRPs possèdent des activités biologiques. C’est notamment le cas des LRR5 et 6 de la décorine et de la LRR11 de la fibromoduline qui sont impliquées dans la fixation du collagène de type I (Kalamajski et coll.

2007 ; Kalamajski et Oldberg 2007). De plus, la LRR5 de la décorine possède une activité anti-angiogénique (Sulochana et coll. 2005). Afin de déterminer la ou les LRR du lumicanne

issus du lumicanne ont été produits, les peptides L 1-9 et L 4-9. Ces peptides ont été nommés ainsi car ils contiennent soit les régions riches en leucine allant de la première à la neuvième soit de la quatrième à la neuvième sur les onze que contient le lumicanne. D’autres constructions plasmidiques ont été réalisées et la production des peptides correspondants est encore en cours de mise au point (Zeltz C., doctorat en cours). Le peptide L 1-9 reproduit les effets du lumicanne. Il est capable d’augmenter l’adhésion et de diminuer significativement la migration des cellules A375. En ce qui concerne le peptide L 4-9, il est capable d’augmenter l’adhésion et ce, de manière légèrement plus importante que le lumicanne entier. Par contre, il n’entraîne aucune inhibition de la migration, contrairement à ce que nous avons obtenu en présence de lumicanne. L’ensemble de ces résultats suggère que le domaine actif du lumicanne se situerait au niveau de la partie N-terminale du lumicanne et plus précisément au niveau des trois premières régions riches en leucine.

Au vu des résultats obtenus en migration et en adhésion, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre les cellules de mélanome et le lumicanne. Funderburgh et collaborateurs (1997) ont montré l’existence d’un récepteur du lumicanne à la surface des macrophages, sans pour autant en déterminer la nature, mais qui serait incapable de reconnaître le lumicanne sous forme protéoglycannique. Dans la dernière partie de nos travaux, nous nous sommes, de ce fait, attachés à caractériser le récepteur du lumicanne à la surface des cellules de mélanome A375 grâce au lumicanne recombinant produit initialement. Il est à noter cependant que celui-ci est totalement dépourvu de chaînes glycanniques car produit dans un système procaryote.

L’adhésion des cellules tumorales à la matrice extracellulaire représente une étape importante des processus migratoires et invasifs. Les intégrines, une famille de protéines transmembranaires hétérodimériques, apparaissent comme étant les récepteurs majeurs par lesquels les cellules adhèrent à la MEC et sont donc, de ce fait, impliquées dans la migration cellulaire. Les intégrines jouent également un rôle dans les interactions entre la MEC et le cytosquelette (Hynes 1992). Au regard de ces données, nous avons examiné le mécanisme par lequel le lumicanne recombinant est capable d’augmenter l’adhésion et d’inhiber la migration des cellules de mélanome humain A375. Nous avons montré l’implication des sous-unités d’intégrines β1 et α2 dans l’adhésion de ces cellules au lumicanne, sans exclure la sous-unité d’intégrine αv.

L’inhibition de l’adhésion par l’EDTA, un agent chélateur, indique que l’adhésion des cellules A375 au lumicanne nécessite la présence de cations divalents. Dans notre étude, le magnésium et le manganèse sont requis alors que le calcium n’a pas d’effet. Les cations divalents et notamment le magnésium sont impliqués dans la fixation du ligand sur les

intégrines (Grzesiak et coll. 1992). Le manganèse augmente l’adhésion des cellules A375 au lumicanne. Le manganèse est un puissant activateur des intégrines et le magnésium confère une adhésion cellulaire similaire (Knorr et Dustin 1997 ; Shimaoka et coll. 2002). En comparaison, le calcium, à forte concentration, est connu comme ayant un effet inhibiteur sur de nombreuses intégrines contenant un domaine I (Shimaoka et coll. 2002). Altieri et collaborateurs (1991) ont montré que le manganèse augmente l’adhésion des polymorphonucléaires au collagène de type I, surtout lorsqu’il s’agit d’une adhésion médiée par des intégrines. Au vu des résultats similaires obtenus pour les cellules de mélanome A375 sur le lumicanne nous avons orienté notre étude sur la recherche d’un récepteur du lumicanne de type intégrine à la surface de ces cellules.

Nous avons étudié l’effet d’un panel d’anticorps monoclonaux bloquants anti-intégrines humaines sur l’adhésion des cellules A375 au lumicanne.

Dans un premier temps, nous avons observé une légère inhibition de l’adhésion, bien que non significative, en présence de l’anticorps anti-intégrine αvβ3, ne permettant pas d’exclure totalement cette intégrine. En revanche, nous avons identifié la sous-unité d’intégrine fixant le lumicanne à la surface des cellules A375 comme étant la sous-unité β1. En effet, l’adhésion des cellules au lumicanne est fortement inhibée (de 60 à 90 %) en présence de l’anticorps anti-sous-unité β1. L’effet bloquant de cet anticorps anti-β1 sur l’adhésion cellulaire indique clairement que le domaine extracellulaire de la sous-unité β1 est impliqué dans l’interaction avec le lumicanne.

Nous avons ensuite déterminé les sous-unités d’intégrines α pouvant se lier à β1 et capable de se fixer au lumicanne. Comme précédemment, l’utilisation d’anticorps

Nous avons ensuite déterminé les sous-unités d’intégrines α pouvant se lier à β1 et capable de se fixer au lumicanne. Comme précédemment, l’utilisation d’anticorps