6. Méthodes de dosage des tanins
6.2 Dosage des tanins par des méthodes simples
6.2.1 Méthode biochimique de Folin-Ciocalteu
Elle utilise le réactif de Folin-Ciocalteu, spécifique des phénols. Elle se décompose en deux étapes de dosages colorimétriques successifs : elle dose premièrement les phénols totaux puis, après ajout de PolyVinyl PolyPyrrolidone PVPP à uiàseàlieàau àta i sàp se tsàda sàl e t ait,àelleà pe etàd o te i àlaàp opo tio àdeàph olsà o -tanni uesàd u àe t aitàa to i ueà Foli àetàDe is,à 1915; Makkar, 2000; Mueller-Harvey, 2006; Rover et Brown, 2013). La teneur en tanins totaux peut être déterminée par différence entre les phénols totaux et les phénols non-taniques.
6.2.2 Méthodes biologiques
Elles se basent sur les propriétés biologiques des TCs :- Méthodes basées sur l’i hi itio d’e z es (trypsine par exemple) (Schofield et al., 2001). - Une méthode basée sur la propriété des tanins à réduire la production de gaz lors de fermentations anaérobies (Makkar et al., 1995; Makkar, 2000; Mueller-Harvey, 2006).
6.2.3 Méthode de précipitation des protéines
La méthode de Diffusion Radiale est basée sur la propriété des tanins à se fixer aux p ot i es.àL e t aitàdeàlaàpla teà àteste àestàpla àauàsei àd u àpuitsàda sàu àgelàd aga oseàetàso à pouvoir de complexation avec les protéines est mis en évidence par la formation de cercles de précipitation dans ce gel (Hagerman, 1987; 2002; Mueller-Harvey, 2006).
6.2.4 Dosage des tanins totaux par la spectroscopie en milieu
infra-rouge proche
Généralités
La technique de spectroscopie en proche infra-rouge (SPIR), située entre les longueurs d ondes 10-6 et 2.5 x 10-6duàspe t eà le t o ag ti ueà Figu eà ,àestàaujou d huiàt sàutilis eà
Figure 13 : ‘ gio sàduàspe t eà le t o ag ti ueàetàlo gueu sàd o deà o espo da tes
La méthode SPIR repose sur le pri ipe de esure de la r fle io ou de l’a sor a e de la lumière par des objets (les échantillons de plantes). Les spect esà olt sàvo tàpe ett eàd ta li à une équation de calibration, par la mise en relation des spectres avec des données chimiques d u eà thodeàdeàla o atoi eàdeàréférence (Siesler et al., 2002; Dykes et al., 2014).
Appareil
L appa eilà peutà t eà u à s stème multicanal, un filtre factoriel, un photomètre à filtre, un spectromètre à réseau, à filtre acousto-optique réglable, à barrette de diodes, à diodes électroluminescentes ou encore un spectromètre à transformée de Fourier, incluant un interféromètre de Michelson : le rayon lumineux en direction de l ha tillo à peutà p e d eà deu à t ajetsà opti uesà différents, une interférence peut donc se créer.
Le rayon lumineux émis par la source va frapper un miroir ou lame séparatrice transmettant 50% deàl i te sit lu i euseàetà fl hissa tà %àdeàl i te sit à esta teà Figu eà à De ouault,à . L appa eilà i f a ougeà p o heà vaà pe ett eà d a u i à desà do es spe trales d’a sorptio des molécules présentes dans les produits analysés. La radiation qui sera émise et entrera en contact ave àl ha tillo àpou aà t eàabsorbée, réfléchie ou transmise Fatela,à .àL i te sit àdeà esà radiations incidentes (I0) sera égale à la somme des intensités des radiations transmises (IT),
absorbées (IA) et réfléchies (IR) : I0 = IT + IA + IR.
Figure 14 : Fonctionnement du
spectromètre à transformée de Fourier (Source : Université Claude Bernard, Lyon)
Spe t eàd a so ptio
Lo s u u à ha tillo àestàsou isà àlaàlu i eài f a ouge,àilàvaàabsorber dans ce rayonnement, à desà lo gueu sà d o deà o p isesà e t eà 780 et 1400 nm.à L a so ptio à deà ha ueà ha tillo à permet la caractérisation de l ha tillo :àl a so ptio àestàtypique de ses liaisons chimiques et physicochimiques (voir figure 15 les groupements chimiques présents pour le spectre du sainfoin). En revanche, à la différence des spectres récoltés en région infra-rouge moyen, il est difficile d i te p te àdesàspe t esàa uisàda sàl i f a ougeàp o he :àlesàpi sàd a so ptio sà e g ti uesàseà
hevau he tàetà e de tàai siàl assig atio àdiffi ileà Giordanengo et al., 2009).
Figure 15 : Spe t eàd u à ha tillo àdeàsainfoin en région infra-rouge récolté par un spectrophotomètre, et ses
absorptions caractéristiques (overtone = oscillation harmonique)
La chimiométrie
C estàlaàs ie eàpe etta tàd’e traire de l’i for atio ara t risa t les spe tres (Fontanges et Chauchard, 2009). Elle comprend des méthodes statistiques qui permettent de transposer des informations obtenues, via la chimie, sur des échantillons. Un nombre conséquent de données spectrales est nécessaire afin de prédire de façon la plus précise possible la valeur des échantillons ultérieurs.
Deux méthodes sont utilisées (Bertrand et Dufour, 2000; Adu-Amankwa et al., 2011) :
- La régression linéaire,à elia tà u eà va ia leà ua titativeà Yà ueà l o à he heà à p di e à à desà va ia lesà à o espo da tà àl a so a e,à àu eàlo gueu àd o deàdo e .à
- La méthode Partial Least Squares (= méthode des moindres carrés) comprend 3 étapes :
- Les données spectrales vont permettre de générer des composantes principales qui seront combinées pour reconstruire les spectres d talo age.
- L a al seà desà oi d esà a sà vaà o pa e à lesà valeu sà p ditesà ave à lesà valeu sà deà références, engendrant, après régression, le vecteur de régression.
- Pou àtoutàspe t eàd u à ouvelà ha tillo à olt ,àleàve teu àdeà g essio àp de e tà
obtenu sera multiplié aux nouvelles données spectrales, permettant de prédire l ha tillo .
Utilisation de la spectroscopie proche infra-rouge en agriculture
Les premiers essais ont été répertoriés avec des analyses de fourrages (Norris et al., 1976). De nombreux constituants ont ainsi été prédits par la SPIR :
- L’hu idit est la plus dominante, due à ses absorptions caractéristiques (1870-1945 nm et 1430-1450 nm) (Roberts et al., 2004).
- Les protéines, avec des prédictions précises (R² > 0.95), dues aux fortes absorptions N-H dans la région infrarouge proche (Mc Graw et Marten, 1986; Roberts et al., 2004).
- Les glucides, fibres, cendres (Gossen et al., 1994; Givens et Deaville, 1999).
La digestibilité etàl énergie métabolisable ont également déjà été prédites via la SPIR (Redshaw et al., 1986; Windham et al., 1991).
E à eva he,àda sàlesàfou agesà àl i ve seàdesàg ai s ,àlesàlipides sont peu souvent prédits, dû à de faibles teneurs et à une variabilité faible, ce qui rend difficile le développement des équations. De même pour les minéraux, les résultats sont souvent de moins bonne précision, en raison de la non absorption des minéraux dans la région infra-rouge (Van Kempen, 2001).
Des études ont déjà conduit au développement de calibrations permettant de prédire la teneur en tanins condensés de différentes plantes comme le lotier (Roberts et al., 1993), le sorgho (Dykes et al., 2014), Lathyrus spp. (Goodchild et al., 1998), sericea lespedeza (Windham et al., 1988; Petersen et al., 1991; Wheeler et al., 1996), Pinus caribaea (Adu-Amankwa et al., 2011), ou diverses plantes méditerranéennes (Mancilla-Leytón et al., 2014).
Ce tai esà tudesào tà gale e tàpe isàd value àlesà apa it sàantioxydantes de maïs ou de miels de différentes origines botaniques (Redaelli et al., 2016; Tahir et al., 2016).
Il existe une grande diversité deà thodes,àplusàouà oi sàsophisti u esàpe etta tàl a al seàdesà polyphénols et plus précisément des tanins condensés.
Certaines méthodes sont spécifiques des TCs comme la méthode au Butanol-HCl mais longues à mettre en œuv e.
La méthode biochimique de dosage de tanins totaux Folin-Ciocalteu est non spécifique des TCs. La méthode de précipitation avec les protéines par diffusion radiale se base sur les propriétés des tanins à se fixer aux protéines. Elle indique le niveau de complexation des TCs avec les protéines mais ne quantifie u i di e te e t les TCs présents.
Enfin, la technique de spectroscopie en milieu infra-rouge proche permetàd ta li àdesà uatio sà de calibration qui pourront prédire les valeurs de nouveaux échantillons de façon rapide.