Dosage des peptides natriurétiques

Les peptides BNP et NT-proBNP ont été initialement dosés par des méthodes radioimmunométriques utilisant l’iode 125. Actuellement, elles ont été remplacées par les méthodes ELISA utilisables en routine et urgence. Quelle que soit la technique, les dosages du NT-proBNP sont issus du même brevet (Roche®) ; s’ils utilisent des anticorps (Ac) de capture polyclonaux ou monoclonaux, ils emploient le même calibrant, d’où une standardisation des trousses « Nt-proBNP » par rapport à celle des trousses « BNP » plutôt hétérogène, car les techniques de dosage du BNP utilisent chacune des anticorps reconnaissant différents épitopes du BNP, donnant par conséquent des résultats variables pour un même échantillon (tableau 4).

31

Tableau 4 : Méthodes de dosage des peptides natriurétiques : localisation épitopique des anticorps [48]

Les résultats du dosage du NT-proBNP sont donc comparables chez un même

patient d’un laboratoire à l’autre contrairement à ceux du BNP. En effet, il n’existe

pas de standard international des techniques de dosages des peptides natriurétiques. Les valeurs de BNP étant dépendantes de la technique utilisée, un seuil décisionnel commun ne devrait pas être utilisé pour les différentes techniques.

Remarque, les dosages du BNP et du NT-proBNP ne sont pas disponibles en même temps sur un même analyseur

Par ailleurs, la présence conjointe dans le sang circulant du précurseur, le proBNP associé aux formes multiples du BNP et du NT-proBNP, est à noter sur le plan analytique : les anticorps utilisés pour les dosages du BNP peuvent reconnaître des épitopes communs au BNP et au précurseur, le proBNP1-108. Cependant Alibay et al ont établi une corrélation entre les résultats de dosage du BNP et du Nt-proBNP (obtenus avec des tests de deux fournisseurs : Roche pour le Nt-proBNP et Biosite pour le BNP) [50]. Cette corrélation n’est influencée ni par l’âge, ni le sexe, ni l’indice de masse corporel des patients. De plus, d'après Waldo et al, le taux de pro-BNP (fournisseur Biorad, anticorps dirigé contre la région entre les résidus 75 à 80) est corrélé avec celui du BNP (fournisseur Biosite) et du NT-proBNP (fournisseur Roche) chez des patients se présentant aux urgences pour une décompensation aigue de leur

32

IC. Par conséquent l'interférence du proBNP dans le dosage des peptides natriurétiques conventionnels n'aura pas de conséquence clinique [51].

Sur le plan préanalytique, le dosage du BNP est préconisé sur plasma, préférentiellement en utilisant l’EDTA (acide éthylène diamine tétra-acétique), et il est interdit sur sérum, car le BNP est instable et sensible à la protéolyse. Le dosage du

NT-proBNP est réalisable indifféremment sur sérum ou sur plasma (mais il est

déconseillé sur sérum, source d’interférences analytiques par les éventuels micro- caillots).

Par ailleurs, les kallicréines activées par le verre dégradent le BNP, mais pas le NT- proBNP. Les prélèvements en vue du dosage du NTproBNP peuvent donc s’effectuer indifféremment sur tube en verre ou en plastique type polyéthylène téréphtalate. Le NT-proBNP a une bonne stabilité pendant sept jours à température ambiante et dix jours à 4°C, alors que la concentration du BNP diminue significativement dès la quatrième heure et d’environ 50 % après 48 heures, probablement en raison de l’action des protéases sanguines. Bien que les dosages des BNP et NT-proBNP soient globalement corrélés, la grande dispersion des valeurs ne permet pas de passer indifféremment d’un analyte à l’autre.

V.2.2 Méthode de dosage au centre hospitalier de Mont-de-Marsan

Le laboratoire dose le NT-proBNP par le système d’immunodiagnostic VITROS 5600, embarquant la technologie Intellicheck® (vérification de toutes les phases critiques du dosage). La technique de dosage en soit est un immunodosage immunométrique impliquant la réaction simultanée du NT-proBNP présent dans l’échantillon avec un anticorps biotinylé (monoclonal de mouton anti-NT-proBNP) et un anticorps conjugué (monoclonal de mouton anti-NT-proBNP) marqué à la peroxydase de raifort (HRP). Le complexe antigène-anticorps est capturé par la streptavidine dans les puits de dosage. Les substances non liées sont éliminées par lavage. Le conjugué HRP lié est mesuré par une réaction luminescente. Un réactif contenant des substrats luminogènes (dérivé du luminol et d'un sel de peracide) et un agent de transfert d’électrons est ajouté dans les puits. La HRP du conjugué liée catalyse l’oxydation du dérivé du luminol, produisant ainsi de la lumière. L’agent de transfert d’électrons

33

(un acétanilide substitué) amplifie le signal lumineux émis et en prolonge l’émission. Les signaux lumineux sont lus par le système. La quantité de conjugué HRP lié est directement proportionnelle à la concentration de NT-proBNP présent (figure 12). Le dossier de validation de cette technique est présenté en annexe 1.

Figure 12 : Immunodosage du NT-proBNP par le système immunodiagnostic VITROS 5600.

- Performances de la technique :

Pour un volume d’échantillon réduit de 40 µl et avec un résultat au bout de 16 minute, cette technique d’amplification du signal permet de descendre à une limite de détection de 11 pg/mL (pg/mL = pmol/L × 8,475). La limite de blanc est de 6,81 pg/mL (0,804 pmol/L). La sensibilité fonctionnelle de ce dosage est inférieure à 10,0 pg/mL (1,18 pmol/L). On la définit comme la plus faible concentration qui correspond à 20% de coefficient de variation inter dosage provenant du profil de précision. La limite supérieure de la Gamme de mesure (linéarité) est de 35 000 pg/mL

- Interférences analytiques de la technique :

Le dosage n’est pas sensible aux interférences visibles (Lactescence – Ictere – Hémolyse). Une hémolyse modérée ne modifie pas les valeurs des peptides natriurétiques quelle que soit la méthode de dosage employée [52]. Les dosages du NT-proBNP ne sont pas influencés par une hyperbilirubinémie jusqu’à une valeur de

34

980 μmol/L [49]. Bien que l’anticorps de capture du NT-proBNP soit biotinylé, la supplémentation du patient par la biotine (vitamine B8) même à dose importante n’influence pas le dosage jusqu’à des concentrations sériques élevées (60 mg/L) [52]. Cependant, classiquement mais rarement, des anticorps hétérophiliques présents dans le sérum ou le plasma de certaines personnes causent des interférences dans les tests d’immunodosage. Alors des résultats incohérents avec les observations cliniques indiquent la nécessité d’analyses supplémentaires.